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(無題) 削除/引用 No.192-10 - 2012/02/28 (火) 11:02:08 - AP AGPC法（製品版としてはTrizol, Isogen, RNAisoなど）のRNA精製原理は酸性フェノール（クロロフォルム添加）抽出ですが、回収した水層をクロロフォルム抽出する過程はなく直接プロパノール沈殿する、ということです。

(無題) 削除/引用 No.192-9 - 2012/02/28 (火) 03:48:15 - Uni AP様の「RNA精製でもクロロホルム抽出しない」というのは興味深く拝見しました。具体的には、組織・細胞が溶けたRNA抽出試薬に直接イソプロ等を入れて遠心してもRNAペレットが得られるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.192-8 - 2012/02/24 (金) 16:47:40 - う 実際の話です。 フェノクロがエタノール沈殿でも除かれる、という話を聞いたとき、 あれ？クロロフォルムで除かれるんじゃなかったか？と 思ったことが実は私もありました。 その時、実際にフェノクロとエタノールを混ぜてみたんですが、 水とフェノクロみたいに分離しませんでした。 ってことはフェノクロはエタノールに溶ける的な（どっちが溶質で溶媒か？） ことかなと。 だから、フェノクロがエタノール沈殿で除けるのかなと。

(無題) 削除/引用 No.192-7 - 2012/02/24 (金) 13:29:09 - AP >EtOH沈やるのであればフェノクロ後のクロロホルム抽出を省略可能って本当ですか？制限酵素処理だけでなくOD測定もほとんど影響ありませんか？ むかし、Amersham（時代がわかってしまいますね）かどこかのマニュアルで（M13ファージDNAの精製だったかライブラリー作製だったか。時代が分かってしまう！）そういう記述を見ていらい、CIAA抽出はしたことがないです。それでも、プラスミドであれば制限酵素消化、標識、シークエンス、in vitro translationなど、ゲノムDNAであればサザンブロット、ライブラリー作製など、遜色なく使えます（もっとも、これらの目的ではNH4OAcの塩析から上清を直接EtOHしてしまって、phenol/CIAA抽出も省略することが多いですが）。 ほかに傍証をあげれば、AGPC (Trizolなど）でRNA精製するときもCHCl3抽出はしないでアルコール沈殿しますが、それでも逆転写みたいな敏感そうな反応でもちゃんと動くし、プラスミド精製マシンのあるものは、phenol処理の過程を含みますがCHCl3抽出せずにアルコール沈殿したりして、それでもそのままサイクルシークエンスにもって行けたりしますし。 ODに対する影響は検討したことないです（ODの測定値が異常だったことは記憶にないし、またほとんどの場合、泳動、EtBrの比色で見るので）。それとTrizolでRNAをとったらOD値を測るのが普通ですが、230とか280が以上に高かったということはないですし、マニュアルにもこの点に関して特に注意書きはないですし。

(無題) 削除/引用 No.192-6 - 2012/02/24 (金) 12:26:33 - クロロ 情報ありがとうございました。等量でよいとのこと、確認できてよかったです。

(無題) 削除/引用 No.192-5 - 2012/02/24 (金) 11:58:19 - 通りすがり 横ですいません、APさんのコメントを興味深く拝見しました。 サザンが目的なのですが、EtOH沈やるのであればフェノクロ後のクロロホルム抽出を省略可能って本当ですか？制限酵素処理だけでなくOD測定もほとんど影響ありませんか？ 私は以下の流れでサザンをルーチンでやっているのですが、1工程省けるのであればとても助かります。 グラム陽性菌から塩化ベンジル法でcrude DNAを取り、酢酸アンモニウムで除タンパクをし、フェノクロ（phase lock使用）抽出（←混ぜたときに不溶物が出現する）、クロロホルム抽出、エタ沈、TE溶解、OD測定、制限酵素処理してサザンブロッティング。

(無題) 削除/引用 No.192-4 - 2012/02/23 (木) 09:35:52 - AP 水層に対して等体積でよいです。 CHCl3とイソアミルアルコールを24:1で混合したものがよく使われます。 イソアミルアルコールは、一説には泡立ちを抑えるためという説明がされますが、入れないと水層が球状にまとまろうとした周りをCHCl3が取り囲んで、水層を分取しにくくなります。 また、あとにEtOH沈殿をする場合、残存したフェノールはほぼ完全に取り除かれるので、CHCl3抽出を省略してもほとんどの用途（酵素処理、トランスフォーメーションなど）で問題ありません。

(無題) 削除/引用 No.192-3 - 2012/02/23 (木) 08:18:14 - Q いいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.192-2 - 2012/02/23 (木) 08:03:53 - Harmonia ぼくは等量。中間層が出るようなら、もう一度等量で抽出。 チューブいっぱいいっぱいまで液が入ると、遠心で漏れて遠心機が汚れるので、7割を超えないようにしている。

クロロホルム抽出について 削除/引用 No.192-1 - 2012/02/23 (木) 02:28:51 - クロロ いつも勉強させていただいていおります。 あるサンプルの除タンパクのためにフェノールを使用する予定をしております。フェノールは水層側にも少し溶け込んでくると思うので、フェノール抽出の後に、クロロホルム単独で再度抽出しようかと思っています。フェノール抽出の際は、サンプルと等量のフェノールを加えればいいと思うのですが、クロロホルム抽出の際はどれくらいの量のクロロホルムを使用するのが一般的なのでしょうか？フェノール抽出と同様、等量のクロロホルムを使用すればよいかと思っておりますが、いかがでしょうか？ 基本的な質問ですいません。

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