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追加 削除/引用 No.180-9 - 2012/02/21 (火) 14:56:56 - PCR nezuさん、失礼しました。 PCRがかからないのは、遺伝子G'特異的プライマー（ForwardプライマーがEx4、ReverseプライマーがEx5'にある）を使って、cDNAをテンプレートとしてPCRをかけた場合です。 ForwardプライマーがEx4、ReverseプライマーがEx6にあるPCRでは、遺伝子G、およびそのスプライシングバリアントG'の両方を検出することになるのですが、この場合はPCRはうまくかかっています。 次のステップで、遺伝子G'特異的プライマーを使って定量的Real time PCRを行いたいと思っています。その目的では、両方を検出するプライマーでは駄目なので、頭を悩ませているところです。

増えてる？増えてない？ 削除/引用 No.180-8 - 2012/02/21 (火) 14:40:48 - nezu 良くわからないのですが、 最初の投稿の下記の文章 >いくつかの組織中では目的のスプライシングバリアントの発現があることは既にわかっています これはPCRで確認出来たという事ですよね？ そして、二回目の投稿の下記の文章 >ある組織ではEx5'（Ex5より100bp程長い）に由来する二本目のバンドが見られたことから、cDNA バンドが出現してると書いてますが、 PCRがかからない、のではなかったんですか？ それとも最初の投稿の”組織”と上記の"ある組織"はPCRで検出出来なかった組織とは別物ということ？ それなら件のvariantが発現していないか、発現量が極小ということでは？

質問書き直し 削除/引用 No.180-7 - 2012/02/21 (火) 13:29:43 - PCR APさんの仰るとおりですね。中途半端に情報を隠しながら書こうとしてわかりにくい文章になっていました。また、質問に答えてくださる方に失礼でした。大変失礼しました。質問文を書き直させてください（簡潔に書こうとしたのですが、既に指摘があった点に対する回答も含めて書いた為に長くなってしまいました。また、writing能力の限界もあります。ご容赦下さい） とある遺伝子Gについて研究しています。この遺伝子Gについて、alternative Ex5を持つ（---Ex4-Ex5'-Ex6---）スプライシングバリアントG'を発見しました。このスプライシングバリアントG'を特異的に増幅するプライマーとして、ForwardプライマーをEx4に、ReverseプライマーをEx5'に設計し、組織から作ったcDNAをテンプレートとしてPCRを行ったのですが、バンドの増幅が見られませんでした。 PCRの条件検討は、遺伝子G'の発現プラスミドベクター（当然上記Ex4-Ex5'-Ex6を含む）を用いて行いました。このプラスミドベクターをテンプレートとした場合には、テンプレート量を相当少量(pgオーダー）にしてもきっちりとDNAの増幅が見られるのですが、同条件で組織から作ったcDNAをテンプレートとしてPCRを行った場合には、バンドが全く見られないのです。 cDNAは、組織から抽出したmRNAを鋳型として、6mer random oligoとoligo ｄTを等量混ぜたプライマーを使ってRT反応を行って作成しました。このcDNAにbeta-actin用のプライマーを使ってPCRをかけたところはっきりとしたバンドの増幅が確認され、また、Ex4にForwardプライマー、Ex6にreverseプライマーを設計してPCRをかけたところ、ある組織ではEx5'（Ex5より100bp程長い）に由来する二本目のバンドが見られたことから、cDNAの質に問題はないであろうこと、また目的とする遺伝子G'をきちんと含んでいる（G'を発現している組織においては）と考えられます。また、この二本目のバンドの太さから、とある組織においてその発現量はかなり強いと推測されます。 使用したmRNAは3-5ug（ゲルに流して、デグってないことは確認しました）、20ulの系で行いました。PCRにはPromegaのGoTaqを使っています。RT反応液の持ち込みがPCR反応を妨げる可能性を考慮して、cDNAはPCR反応液の1/50までしか加えていません（この量で、beta-actinおよび上記の二本目のバンドを確認しました）。 プラスミドではPCRがかかるのに、cDNAではかからない場合には、どのような可能性が考えられるでしょうか？PCRに詳しい方、心当たりがありましたら教えていただけないでしょうか？よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.180-6 - 2012/02/20 (月) 19:50:22 - Harmonia 直前のKYさん提案の検討をするとき、プラスミド数コピーのみをPCRのテンプレートにするだけでなく、プラスミド数コピーを含むcDNAをもテンプレートにすると、cDNAプールに阻害物質が紛れ込んでいるか、という検討ができます。

(無題) 削除/引用 No.180-5 - 2012/02/20 (月) 16:50:21 - KY プラスミドとcDNAは全く違うと思います。 プラスミドは大量にtemplateが存在するわけですし（どのくらいの濃度を使用したのかわかりませんが）、cDNA（トータルcDNAを使用した？）は様々なcDNAを含んでいるし、目的のcDNA templateは少ないかもしれない。 少なくとも、数コピーのプラスミドテンプレートでもそのプライマーを用いてPCRで検出できているなら、cDNAで増幅しないのはおかしいと思いますが、検討されておりますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.180-4 - 2012/02/20 (月) 16:15:39 - AP もっと要領よく整理された、要点をついた文章を書きましょうよ。 何を言いたいのか理解するのに相当の労力が必要ですよ。 とりあえず、「もとの遺伝子」、「もとの遺伝子用プライマー」とは何のことを言っているのか（ゲノム上の遺伝子のこと？）、「その遺伝子の発現ベクター」のインサートは目的のアイソフォームであるということでいいのか、説明求む。

(無題) 削除/引用 No.180-3 - 2012/02/20 (月) 16:04:56 - う 基本的なこととして、 cDNAを作るとき、ランダムプライマーorオリゴdTプライマーで cDNAの伸びが異なる。 つまり、オリゴdTで作った場合、 5'末端領域に設定したプライマーでPCRすると cDNAがそこまで伸びてきていない場合があるのでPCRがかからない。 プラスミドDNAをテンプレイトにしたとあるが、 そのとき加えた量とcDNA中に含まれる量がどうなのか 考えたことはありますか？ また、cDNAには他にいろいろなcDNAが含まれる プラスミドDNAは単一のテンプレイトとなるべきDNAしか含まれない。 このこのことを考えたことがありますか？ これらのことを考えて、cDNAの質がどうであるのか？ PCRの条件はどうなのか？を考えるべきではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.180-2 - 2012/02/20 (月) 14:13:13 - ~ プラスミドからならば適当な条件でも増えますが、cDNAからはそうはいかないことが多いかと思います。 温度等の条件検討を再度行なってはいかがでしょうか。

plasmidではかかるが、cDNAでPCRがかからない 削除/引用 No.180-1 - 2012/02/20 (月) 14:06:33 - PCR ある新規スプライシングバリアントの臓器ごとの発現を調べるため、組織からのmRNA抽出、RT反応でcDNAを作成、その後にPCRを行っています。PCRの予備実験として、その遺伝子の発現ベクターをテンプレートとして、そのスプライシングバリアント特異的なプライマーを作成してPCRを行ったところ、目的のサイズのバンドを増幅することが出来ました。同じプライマー、同じPCR条件で、cDNAをテンプレートとしてPCRを行ったところ、全くバンドの増幅が見られませんでした。同じcDNAを使ってbeta-actin用のプライマーでPCRを行うと目的サイズのバンドの増幅が見られますし、元の遺伝子用のプライマーでもくっきりとバンドが見られるので、cDNAの質は問題ないと考えています。また、この元の遺伝子用のプライマーはスプライシングバリアントを検出することも出来る（ある組織では元の遺伝子由来のバンドと、スプライシングバリアント由来のバンドの二本のバンドが出る設計になっている）ので、いくつかの組織中では目的のスプライシングバリアントの発現があることは既にわかっています。 プラスミドをテンプレートとした時はうまくいくのに、cDNAをテンプレートとした時にはPCRがかからない場合、考えられる原因はなにがあるでしょうか？ PCRの条件検討（アニーリング温度、MgCl2濃度、プライマー濃度など）はプラスミドをテンプレートとしての予備実験でやりました。cDNAはPCR反応液の1/50（0.5ul in 25ul）を使っています。rTaqはPromegaのGoTaqを使っています。PCR反応液には2ul(in 25ul)　のDMSOを加えています。 PCRに詳しい方、なにか心当たりがありましたら、よろしくお願いします。

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