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(無題) 削除/引用 No.180-30 - 2012/02/22 (水) 14:29:33 - う AP様の文章で漸く意味が分かりました。 ＞・RT-PCRでexon4-exon5'間の増幅が認められない。しかし、exon4-exon6ではexon5'を含む想定の産物が得られる。これに合理的な説明がつくだろうか。 PCR様は「私の言っていることはわかるが、ここでは当てはまらない」と 言ってもらわないと無駄な話だけが進むのみです。 AP様のおっしゃる通り、本質がわかりづらい。 完全に、 PCRという操作上の問題を聞きたいと思っている回答者、 AP様がご指摘の「ごくごくPCR様に特異的なケース」と思っている回答者、 が分かれているかと。 それはさておき、とりあえず乗りかかった船ですので 最後に私の考えを残します。 もう一度、目的産物とプライマーの配列を、 何か違いが無いかチェックした方がいいのでは？ です。反応条件をいじられるのは止めはしませんが、 私が長いおせっかいで述べた通り、3'側の１つの塩基が違っただけで PCRはうまくいきません。

(無題) 削除/引用 No.180-29 - 2012/02/22 (水) 14:23:29 - PCR >APさん いや、今でも私が欲しいのはcDNAをテンプレートに、Ex4-Ex5'プライマーでのびしっとした一本バンドなのです。なにせ次にこれをReal Time PCRの系に持っていって、GとG'の発現量を定量するように上から指示されておりますので。 ただ、APさんが仰る「合理的な説明」があるのであれば、もちろんそれを知りたいと思います。 >やまさん リニアにしてからやった方がよい理由というのはなんでしょうか？cDNAにより近い形に変えるため？（二本鎖と一本差の違いはありますが、環状よりはこっちの方が状態が似ているから？）教えていただけますか？よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.180-28 - 2012/02/22 (水) 14:03:18 - PCR >~さん とりあえず温度をプラスマイナス2度で変えてみましたが、残念ながらバンドは見られませんでした。cDNAであればこう変えた方が良い、というような一般的な変更点が存在するとして、もしご存じでしたら教えていただけますか？ >KYさん 先に書かせていただいた通り、ある組織ではG'のかなりの発現量があると思われるのですが、残念ながらこの組織から作ったcDNAでもPCRがかかりません。 >Harmoniaさん、やまさん、お粗末君さん cDNA中に強力な阻害物質が紛れ込んでいるということは無いようです。プラスミドは環状のままです。 >うさん 長い文章で返信いただきありがたく思います。ただ、やはりあなたの最初の指摘、次の指摘から、仰りたい内容を想像するのは私には難しかったと思います。その理由は、特に最後の指摘に納得いかない部分があるからなのですが。 繰り返し「非特異的にプライマーがくっつく」可能性を指摘されていますが、プラスミドではびしっと一本バンドがでるようなプライマーとPCR条件で、cDNAでは非特異的にいろんな場所にくっつく、それもスメアなバンドになることすら出来ない程いろんな場所にくっつく、というのはあまり現実的な解釈では無いと思います（genomic DNAに対してちょっと怪しいプライマーでならあり得るかもな、とは思いますが）。そもそも、私にはその「スメアが薄くなって見えない状態」という話は全く信じられません。その見えないスメアというのを、うさん自身はなにか電気泳動以外の別の方法で確認されたことはあるのでしょうか？あるいは、そういった「スメアにすらならない程少量の非特異的産物」は実際に形成されることがあり、それがPCR反応を妨げるといったことが書かれた論文なりテキストブックがあるのでしょうか？もしご存じでしたら教えて下さい。 こちらの皆さんの書き込みは全てありがたく読ませていただいておりますが、納得のいかない、あるいは言いたいことがわからない回答に対して、その点を尋ねることは逆に質問者の責務でもあると思っており、その意味で質問させていただいております。 >aaaaさん Ex5は80bp、Ex5'は180bpです（おおよその数字です）。 >Qさん 確かに、cDNAで条件を検討することになれば、ケースバイケースなので特効薬は無いのかもしれませんね。genomic DNAなら立体構造形成阻止の為にDMSOかベタインを入れろなどあるのでしょうが。ただ、個人的にはプラスミドで得られた条件から大幅にかけ離れた条件になるというのはかなりまれなケースだと思う（論理的根拠はありませんが・・・）ので、cDNAを節約したい今の状況では、完全な無駄だったということはないと思っています。 >通りがかりさん まさに仰るとおりの状態になってしまいました（笑）。今考えているのは、全く別のPCRサイクルを試すことですが、これは時間がかかるのでまた後ほど報告させていただきます。

途中報告 削除/引用 No.180-27 - 2012/02/22 (水) 13:59:34 - PCR レスを下さった皆様、ありがとうございました。その後の経過を報告させていただきます。結果からいうと、未だcDNAでバンドは得られていません。 まず一番強くG'を発現しているcDNAを5倍希釈して、これをテンプレートDNAとしてEx4-Ex6プライマーでPCRをかけたところ、十分に太いバンド（100bp大きいもの）が得られました。この5倍希釈cDNAをテンプレート（0.5ul in 25ul)にして、プラスミドで決めたアニーリング温度より-2、-1、+1、+2度でEx4-Ex5'プライマーでPCRをかけました（他の条件は変更無し）が、バンドは得られませんでした（同時にプラスミドをテンプレートにしたチューブも用意し、手技上のミスが無いことは確認しています）。 上記のcDNAとは別の組織から作った、G'をそれなりに発現しているcDNAを5倍希釈して、Ex4-Ex6プライマーでPCRをかけ、faintとまではいかないものの細いバンド（100bp大きいもの）を得られました。この5倍希釈cDNA0.5ulに、0pg、5pg、50pg、500pgのプラスミド（それぞれ1ul、希釈には水を使いました）を加えてEx4-Ex5'プライマーでPCRをかけました。同時に、それぞれの量のプラスミドだけでもEx4-Ex5'プライマーでPCRをかけました。結果は、プラスミドを加えたサンプルと加えなかったサンプルでそれぞれ同じような太さのバンドが見られました（Real time PCRでは無いため、はっきりどれ位違うとはいえませんが、見た目違いなしです）。プラスミドを加えなかったサンプルではバンドは見られませんでした。G'の発現が全く見られない細胞から作ったcDNAでも同じ実験をしましたが、同様の結果でした。プラスミド由来のバンドが、cDNAと合わさることで減弱するということはないようです。

(無題) 削除/引用 No.180-26 - 2012/02/22 (水) 12:55:47 - やま plasmidのみで掛かるけどcDNA+plasmidは掛からない→cDNA中に阻害物質がある または、期待ほどcDNA中に目的ターゲットは存在していない （plasmidの濃度を振ればある程度はどちらか見分けが付くはず） cDNA+plasmidで掛かる→cDNA中に問題になるほど阻害物質はない →cDNA中の目的ターゲット量が少ないorプライマーを変えた方が良い 少しは検討材料が手にはいるのでは？と思います。 （plasmidを環状のままやってるのでしたら、制限酵素カットして リニアにしてからやった方が良いと思います。）

(無題) 削除/引用 No.180-24 - 2012/02/22 (水) 12:15:50 - AP 最初から指摘したように、何が要点なのかわかりにくい質問でしたが、この場でいくつか問答をした上で私が理解した質問意図は、先に書き込んだとおりです。 質問者さん自身が、問題の本質、ポイントを整理しきれていないうちに質問したために、論議をミスリーディングした感がありますが。

(無題) 削除/引用 No.180-23 - 2012/02/22 (水) 11:53:44 - Q >単純に「plasmidではかかるが、cDNAでPCRがかからない」ということなら え、こういうことではなかったのですか？

(無題) 削除/引用 No.180-22 - 2012/02/22 (水) 10:35:03 - AP 問題点を要約すると ・RT-PCRでexon4-exon5'間の増幅が認められない。しかし、exon4-exon6ではexon5'を含む想定の産物が得られる。これに合理的な説明がつくだろうか。 ということですね。 それで、プライマーデザインが悪いからではないかという疑問に対しては、cDNAクローンを鋳型にすればexon4-exon5'間のPCRもかかるので問題はないだろうということを挙げているわけですね。 単純に「plasmidではかかるが、cDNAでPCRがかからない」ということなら、逆転写の効率、標的の含有量、cDNAのcomplexityなどいろいろな要因があるから、そういうこともあるだろうさ、というだけですが、この質問に関しては論点を外れているんじゃあないですか。

(無題) 削除/引用 No.180-21 - 2012/02/22 (水) 10:25:54 - Q 個人的にその混ぜるときのプラスミドDNAの量ははどの位から始めるのか難しいと思います、興味があります。いずれにしても当事者でないので無責任な話ですみません。

(無題) 削除/引用 No.180-20 - 2012/02/22 (水) 10:22:53 - 通りがかり 水掛け論and仮定の話で申し訳ありませんが、 cDNA＋プラスミドを混ぜた液で、現在プラスミドだけでうまくいく条件がうまくいった場合はどうなるのでしょうか・・・。cDNAではうまくいっていない今の状況はかわらないのですものね。 というもの、個人的にそうなる気がするのです、あくまで個人的に。 PCRさんがどうされるかはわかりませんが、頑張って下さい。

(無題) 削除/引用 No.180-19 - 2012/02/22 (水) 09:51:33 - お粗末君 質問者様がそのmRNAは絶対に発現していると断言しているのですから。 問題は、ｃDNAの量などPCRの条件が悪いからどこを直せば良いかという問題になると思います。 ｃDNAを無駄にしたくないのにｃDNAで条件検討をしたらすぐ極めて無駄です。 Harmonia様が最初に助言しているように、cDNA＋plasmidでPCRをやれば、阻害がかかっているのか、そもそもｃDNAの質が悪いのかがわかります。ｃDNAも最小限で済みます。 これが最も最初に知りたい情報では？ それから、次の方策を考えませんか？

(無題) 削除/引用 No.180-18 - 2012/02/22 (水) 08:33:18 - Q もともと組織や細胞で発現している目的のmRNAを 自前のプラスミドDNAで再現するみたいな方法に どれだけの意味があるのかと思うときがあります。 プラスミドDNAをpgオーダーで加えてうまくいく とかあったとしても、逆転写したcDNAに目的のものがpgオーダーで 存在するのかどうかわからないですし。 結局、cDNAを鋳型にしたPCRはうまくいかなければ 意味がないですよね。 しかも、cDNAと混ぜたプラスミドDNAでPCRって cDNAを無駄にしたくない質問者さんの気持ちと その混ぜたものでやってうまくいったからといって どうなんでしょう。 やはり、cDNAを用いた条件検討が一番なんだと思います。 気持ちはわかりますが、バンドがでないから出るいい方法はないのか という質問にいつしかチェンジしているようですが、 それはケースバイケースなので、特効薬はないと思います。

(無題) 削除/引用 No.180-17 - 2012/02/22 (水) 04:18:29 - やま cDNAにplasmid DNAを入れたものをテンプレートとしてPCRをやってみるのは どうでしょうか？ 予備実験の濃度と、余裕があれば濃度を振った物を作って。 （同時にplasmid DNAのみも行った方が良いと思います。） もし、掛からなければcDNA中に阻害物質があったり cDNAではPCRの条件が違う等の可能性が高くなると思われます。 また、plasmid DNAは環状のままですか？ 制限酵素カットとかはしていますか？

(無題) 削除/引用 No.180-16 - 2012/02/21 (火) 18:00:58 - aaaa Exon5は何bpでExon5'は何bpなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.180-15 - 2012/02/21 (火) 16:15:43 - う PCRに詳しい人に心当たりを聞いている割には 自分の意見以外は否定していらっしゃるようなので 書く意味があるのかわかりませんが、一応。 まず、１つめにポリメラーゼの性質が挙げられます。 ポリメラーゼはその性質上、 プライマーの３’末端がきっちりアニーリングしていないと DNAを伸ばすことができません。 ２０塩基のプライマーの５’側の１９塩基がくっ付いていても ３’側の１塩基がくっ付いていないだけでDNAの伸びません。 すると、可能性のひとつとして、cDNAの中には色々なcDNAがあるので いろいろなサイトにつっついた結果、PCRがかからない原因になっている かもしれないということです。 逆に、２０塩基のプライマーの内、５’側の１０塩基がくっ付いていなくても ３’側の１０塩基がくっ付いていればDNAの伸びる可能性があります。 この可能性も含めて、２つめに、PCR産物があるからといって泳動では見えない ということがあります。 これは、特異的なPCR産物が薄くて見えないということではなく（それもあり得ますが） いろいろな大きさの非特異的なPCR産物がバンドを形成するとは限らない、 ということです。 よくPCRで「スメアになる」ときがありますが、 そのスメアが薄くて見えないというのを想像してもろうと近いと思います。 つまり、cDNAの中のいろんなcDNAから不特定のPCR産物が出来ているのだが、 その不特定の産物が集まっても、泳動で見える量ではない、ということです。 これは、もとのテンプレイトcDNAの総量が少なく、かつ プライマーがいろんなところにくっ付いた結果になり得ます。 ということで、cDNAと単一プラスミドの場合では、 条件が異なることがあるのです。 ご自分が想像できなかったからといって、真っ向から否定されていては、 良いアドバイスであっても聞き逃すことがありますよ。

(無題) 削除/引用 No.180-14 - 2012/02/21 (火) 15:49:11 - Q 結局のところPCRかからないのだからcDNAとプラスミドでは違うよという話に対しては どう思われるのですかね・・・。 これがPCRに詳しい方々からの心当たりだのですけどね。

(無題) 削除/引用 No.180-13 - 2012/02/21 (火) 15:48:04 - PCR うさん 申し訳ないのですが、おっしゃることがよくわかりません。cDNAとプラスミドは全く別物だから、同じ条件でもプラスミドではかかってもcDNAではPCRはかからないことがあるとおっしゃりたいのでしょうか？ >cDNAには、目的配列を似たような配列もあれば、 いろいろなcDNAがあります ということを考えるならば、似たような配列にプライマーが非特異的にくっついて、複数バンドが出ることの方が考えられると思うのですが、私の場合は全くバンドが出ないのです。 別物だ、というのはわかるのですが、私としては、KYさんの >少なくとも、数コピーのプラスミドテンプレートでもそのプライマーを用いてPCRで検出できているなら、cDNAで増幅しないのはおかしいと思います という意見に同意します。また、先の投稿で書いたのですが、ある組織から作ったcDNAでは、目的のスプライシングバリアントが強く発現しているであろうことが予測できるのですが、このcDNAをテンプレートにしてPCRをかけても、全くバンドが出ないのです。 プライマーに関しては、実は二種類試しているのですが、どちらでも駄目でした。プライマーの設計はPrimer3で行っています。 実際にバンドが出ていないので、cDNAを使って条件を検討しろ、と言われるのはわかるのですが、もしご存じでしたら、なにか指針のようなものを教えて頂けたらありがたいのです。量に限りがあるため、出来る限りcDNAをセーブしたいのです。よろしくお願いします。

そこは間違いないです 削除/引用 No.180-12 - 2012/02/21 (火) 15:13:58 - PCR APさん >Exon4-Exon6でPCRをかけたときの100 bp大きな産物というのが本当にExon5'を反映しているのでしょうか ここは間違いありません。というのは、この100bp大きい産物をゲルから切り出してシークエンスを読んでいるからです。また、G'発現ベクターというのは、実はこの産物をG発現ベクターの相当の場所に入れ替えて作りました。プライマーは、読んだシークエンス上に存在するように設計してあります。なので、プライマーが存在しない配列に設計されているということは無いはずです。

(無題) 削除/引用 No.180-11 - 2012/02/21 (火) 15:06:21 - う 申し訳ありませんが、長い文章を読み込んで ここがどうとか言う前に、基本的なことに対する リアクションがないので、それを一度書きます。 cDNAには、目的配列を似たような配列もあれば、 いろいろなcDNAがあります。 そのようなcDNAの海の中で行なうPCRと それ単一のプラスミドDNAだけを含む井戸の中でのPCRとでは 全く同じ反応条件でもうまくいくとは限らないです。 後のPCRのどうのこうの正しさについては、 ご自分で正しいはずとチェックされて下さい。 ただ、上記のようなことがもあり得るということ。 これは理屈ではなく、いろいろなプライマーを試す必要もあるということです。

(無題) 削除/引用 No.180-10 - 2012/02/21 (火) 14:59:08 - AP まず疑問なのは、 Exon4-Exon6でPCRをかけたときの100 bp大きな産物というのが本当にExon5'を反映しているのでしょうか。実は中身がExon5'ではないので、Exon4-Exon5'ではPCRがかからないとか。 >nezuさん >>ある組織ではEx5'（Ex5より100bp程長い）に由来する二本目のバンドが見られたことから、cDNA >バンドが出現してると書いてますが、 >PCRがかからない、のではなかったんですか？ その誤読はないわー

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