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(無題) 削除/引用 No.180-72 - 2012/03/02 (金) 00:03:22 - あああ あれ以来気になって立ち寄ってみましたが よかったですね！ 原因についてはとりあえず、この際もうどうでもいいでしょう！w

(無題) 削除/引用 No.180-71 - 2012/02/25 (土) 07:00:36 - どんぐり PCRが成功してよかったですね。 今回の件はどっちもどっち、質問の要点を上手く説明できなかった質問者と、それにイライラする回答者。それに対する質問者の返答も大人げない。それにつられて回答者もヒートアップ。 ただ一番の問題は、人を小馬鹿にしたような回答者の方もおられるようで、あまり気持ちのよいものではないです。そのせいで質問者の返答がおかしくなってきて、最終的に荒れてしまったのでしょうね。質問者を攻めるのは簡単ですが、お互い様です。回答している方はある程度研究歴の長い大人ですよね？たぶん。

(無題) 削除/引用 No.180-70 - 2012/02/24 (金) 23:45:44 - い PCR成功おめでとうございます！

(無題) 削除/引用 No.180-69 - 2012/02/24 (金) 17:36:20 - お粗末君 今の時代、ハイスループット化はとても重要な課題です。 real-time PCRもそうですがクローンテックのinfusionなどを用いて多検体の処理を行なう場合 プライマーの設計位置を気にしたくないものです。 もっともそうなプライマーでも走りにくい場合の原因究明は大切で、荒れましたが 原因究明まではいかないまでも走る条件が見つかったことは良い参考になりると思います。

(無題) 削除/引用 No.180-68 - 2012/02/24 (金) 14:52:09 - PCR とりあえずバンドが出たので、解決済みとさせて頂きます。暗証番号を入れわすれたので解決済みマークは出ませんが、ここで閉めとさせて頂きます。皆様のアドバイスは有用なものが多く、今後の私にとって非常に役立つものだったと思っています。ありがとうございました。 AP様に言われるまでもなく、自分の情報伝達能力の未熟さを痛感しています。当面なにか疑問があってもトピを立てたりするのは自粛します。このような結末で申し訳ありません。 最後に、特に >お粗末君様 「質問者様がそのmRNAは絶対に発現していると断言しているのですから。」と言って頂いて、その上での問題解決方法を考えて頂けたのは涙が出るほどありがたかったです。本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.180-67 - 2012/02/24 (金) 14:51:35 - R 2 step PCRについて以前、real-time PCRのメーカー (R社)の方から以下のように聞いたことがあります。 特許の関係?で説明書等に記載できないが、 3 stepよりも2 stepを推奨する。 理由の一つとして、アニーリング温度までの加温・冷却の間にも反応が起こり、変な産物ができる可能性がある。 ご参考までに。

なんだそれ！と言われるのが怖いのですが・・・ 削除/引用 No.180-66 - 2012/02/24 (金) 14:23:23 - PCR >特にtoyoさん KYさん、Harmoniaさん、abさん、またレスを下さった皆様 （今更？と思われるかもしれませんが、どうしても気になったので）Ex4-Ex6、Ex4-Ex5'を使い、G'発現プラスミドさらに0.0005pgまで希釈していってPCRをかけてみました。結果は0.0005pgでもどちらのプライマーセットでもしっかりバンドが見られました。この濃度のプラスミドを、G'を少量発現していると思われるcDNAに混ぜてEx4-Ex5'でPCRをかけてみました。結果は、cDNAのみではバンドは見られず、プラスミドのみ、プラスミド+cDNAでは同程度の強さのバンドが見られました。この結果から、cDNA中に5'プライマーが非特異的にくっつくような配列が数多くあったりはしないであろうこと、しかし逆に5'プライマーは私のPCRの条件ではcDNAにアニールしないであろうことが予測できました。abさんの仰るプライマーの認識能の問題なのでしょう。 それで、新しいプライマーを注文する前の最後の試みとして、PCRのやり方を変えて試してみました。今までは普通のdenature、annealing、elongationの3ステップのPCRでやっていたのですが、今回はdenature95C 30sec、annealing+elongation68C 10minを繰り返す2stepのPCRです。これは、以前○○賞受賞者の偉い先生からきいたやり方で、私は教科書などを読んで知ったやり方では無いのですが、この先生はどんなPCRでもこのやり方で絶対増えると豪語されていて、実際私も以前長い領域を増やすのに手こずった時にこのやり方でやって成功したことがあります。200bp以下の短い産物を作るためにこのやり方を試すのは初めてで、自分自身（仮に増えても、ノンスペもでまくるような気がするな）と半信半疑でやってみたのですが、きれいな一本バンドが出ました。少なくともEtBr染色ではノンスペは確認できず、また、このPCR産物を制限酵素処理して大きさを確認すると正しいサイズのバンドが得られます。G'特異的PCR産物で間違いないと思います。 けして皆様のアドバイスを無視したわけではないのですが、全然違う方向からのアプローチでバンドが出たので、これを報告したものかどうか考えたのですが、やはり、時間をとって色々とアドバイスを頂いた以上、ことの顛末をきちんと書くべきだろうと思って報告させて頂きました。そんな手があるなら最初から試せばよかったろう（あるいは試してから質問しろ）とお叱りを受けるかとビクビクしているのですが、私自身最後の手段だと思っていて、また本当にうまくいくとは思っていなかったのです。平にご容赦願いたい。

(無題) 削除/引用 No.180-65 - 2012/02/24 (金) 08:22:07 - あぁ ＞「プラスミドをテンプレートとした時はうまくいくのに、cDNAをテンプレートとした時にはPCRがかからない」 というのは、多くの人が経験しており nnnさんに同意します。この経験があることをみんな伝えようとしているけど、質問者さんのそんなことあり得ないだってこんな結果（それ最初に的確に書いてくださいよ！）があるからと否定されるの繰り返しでしたね。 あと老婆心ながら、これだけ荒れたトピックになったことから、質問者さんのリアルは充実しているのかと心配してしまいます。人との受け答えは研究している人にとって助言をもらったり研究を円滑に進めることに重要ですから・・・・。 この人大丈夫か？と思っているだろう返信者の方々は、質問者さんのこれからのコメントに注目しています。まぁ、ここでどう思われようと関係ないか。

(無題) 削除/引用 No.180-64 - 2012/02/23 (木) 23:44:06 - AP はい、　つ3000キルド 固定観念云々といったのは、そんな即物的なことではないつもりだったんですが。決してexon 4-6のPCR産物に5'が含まれていることを100%疑っていたわけではありません（だから賭け金も少なめでしたし）。それまでに提示された情報からはそういう可能性も否定できないでしょう（あなたの書いたことだけが情報源なのですから）。さらに、情報が要領を得なくて断片的だったために、それまでの流れで寄せられた回答は提示された情報をすべて汲み取って、なるほどそうかもしれないと腑に落ちるようなものがありませんでした。なぜexon 4-5'が増えないのかということにのみに集中して、exon 4-6が増えるということと整合性のある回答はありませんでした。そのため、前半の回答は、的外れな（cDNAプールにPCRに阻害性があるのではないかとか、cDNAにクローン化DNAを混ぜて検討しろとか）に終始してしまったように見えます。exon 4-6が増えるという事実を無視して、なぜexon4-5'が増えないのかに固執しているだけでは、それを解決する正解には行き着かないということを言いたかったんですが。 それはそうと、あなたの情報発信力の未熟さで、ずいぶん長いスレッドになってしまったことを反省してください。最初から必要な情報を要領よく書いていれば、もっと早く正解（PCRプライマーを二通りだけではなくもっと試して、増幅効率の良いものを使うしかない）が出ていたであろう、極めて単純な問題であったのに。前半の無駄になってしまったレスをくれた人たちに申し訳ないでしょう。自分で言うのもおこがましいかもしれませんが、議論がようやく確信に迫ったのは私がかき回したからじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.180-63 - 2012/02/23 (木) 23:28:14 - nnn みなさん書かれているように、 解決法は、 リアルタイムPCRの系で解析したいのならば、 実際にリアルタイムPCRで使うPCR試薬と、 cDNAを使って、リアルタイムPCRマシーンでメルティングカーブの確認も行いつつ、 条件検討する事になるでしょう。 cDNAは、高発現している臓器のRNAから、それだけcDNAを１チューブで作って、 条件検討用に使えばいいだけだと思います。 たしかに、各種臓器から同じ時に作成したcDNAセットは、 本番の解析用にとっておきたいというのは、十分に分かります。 あと、経験的に増幅効率が悪い領域は、プライマーを変えてもあまり改善せず、 増幅する領域を変えたらうまくいくこともありました。 最初の質問の > プラスミドをテンプレートとした時はうまくいくのに、cDNAをテンプレートとした時にはPCRがかからない場合、考えられる原因はなにがあるでしょうか？ の「プラスミドをテンプレートとした時はうまくいくのに、cDNAをテンプレートとした時にはPCRがかからない」 というのは、多くの人が経験しており、 原因というか候補要因もありすぎて、 その原因を確かめる実験をするのが時間の無駄になりかねず、 経験的に、温度など検討しても対して改善されないケースが多いため、 プライマーの再設計以外にないということを知っていると思います。 これまでに挙がった原因の候補以外にも、 cDNAの場合、PCRのターゲット領域の外側の配列との２次構造（ヘアピン構造など）を作っていてプライマーが付きにくいケースもあるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.180-60 - 2012/02/23 (木) 22:34:27 - あい 長いので流れ、実験の順番も理解出来ていませんが、 念のため、今調製しているcDNAでもEx4-Ex6プライマーでPCRしたPCR産物からEx4-Ex5'プライマーでの増幅確認はやっておいてもいいんじゃないでしょうか。それから、プライマーの設計し直しかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.180-59 - 2012/02/23 (木) 22:27:11 - 通りがかり あ、すみません。下のPCRさんの書き込みを見る前に書き込んだコトしたのでもういいです。さらに、気分が悪くなることになりましたが。。。 少なくとも、数人から同じように混乱と返信に対する否定などの苦情が挙がっていることを少しは考えてきることも、お勧めします。それを認めたくないこともわかりますがやっぱり、そう言われる理由もあると思います。ふぅ。

(無題) 削除/引用 No.180-58 - 2012/02/23 (木) 22:19:26 - 通りがかり PCRさん もうちょっと冷静にしましょうよ。あなたの書き込み気分悪くなります。 で、結局、5'プライマーに関するあなたの考察はどうなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.180-57 - 2012/02/23 (木) 22:15:32 - PCR >KYさん 実際に検量線を引いたりしているわけではないですが、Ex4-Ex6プライマーとEx4-Ex5'プライマーは、少なくともプラスミドに対しては強い増幅効率をもってPCRをかけてくれます。それがなぜcDNAでは駄目なのか、相当量のG'の発現があるはずと思われるcDNAでも駄目なのか、途方に暮れています。 >Rさん、りんさん、nnnさん、abさん、aaaaさん プライマー再設計が一番の近道だろう、ということですね。私がひっかかっていたのは、二種類のEx4-Ex5'プライマーを設計して両方で実験したのですが、両方ともプラスミドではきちんとした増幅をするのに、どちらでも強いG'の発現を持つと思われる組織のcDNAではワークしなかったことです。二つ位ではうまくいかないというのは珍しいことではないと言われると、正直に言えばそうなのか？と思う気持ちが無くはないのですが、それが私の経験不足なのでしょうね。プライマーの再設計も検討してみます。 >やまさん 申し訳ありません。また誤解を生む書き方をしてしまったようです。No.180-27で元々のcDNAを希釈したというのは、単にcDNAをセーブするためです。PCR産物を希釈してPCRに使ったということではありません。 制限酵素で調べる、というのはすっかり失念しておりました。折を見て、必要に応じてやってみようと思います。ありがとうございます。 >Qさん、後半APさん 申し訳ありませんが、なぜに怒られるのかさっぱりわかりません。私は終始一貫してEx4-Ex6プライマーで増やした産物にはEx5'が含まれている前提で説明してきました。それは間違いないはずという私の認識を「固定観念に固執している」と言われる程にです。実際、APさんに言われるまで疑う必要性に気づかなかった位です。それが「試している」とまで言われるとは、というのが正直な気持ちです。質問に書いた前提が覆った、しかも覆ることを私が既に知っていたのに書かなかったというなら怒られるのもわかりるのですが。 完全に愚痴になりますが、そもそもNo-180-10、No-180-12のようなやりとりをやった相手からそのcDNA中のEx5'とクローニングしたEx5'は同じか？とか言われるとは想像も出来ませんでしたよ。やっぱり3000ギルドきっちり払ってもらわないといかん。

(無題) 削除/引用 No.180-56 - 2012/02/23 (木) 22:15:00 - aji No.180-51のQさんの指摘の通り、無駄に皆さんを混乱させているように思えてならないのですが、暇人なのでコメントさせて頂きます。 cDNAがもったいないのは組織ごとに作ったりするからだと思うので、ゲノミックDNAで条件検討できませんか。イントロンが長すぎて無理かもしれませんが。 プラスミドで条件検討する場合には既にご指摘のあるようにpgどころじゃなく濃度を下げたり、サイクル数をぎりぎりまで下げていくとEx4-Ex6のプライマーセットが実は極めて優秀なことが分かるかもしれません。 などなど、結局皆さんと同じ意見です。プライマーを検討するのがいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.180-55 - 2012/02/23 (木) 22:12:44 - う 申し訳ありませんが、もうアドバイスする気はありません。 頑張ってください。

(無題) 削除/引用 No.180-54 - 2012/02/23 (木) 21:18:41 - PCR >APさん（シャレの通じる方と見込んで） あー、おまえわかってねえわ、これはそのクローニングが間違ってんだよ完全に、わかんねえのかねえ、ま、固定観念に固執する野郎じゃそんなもんだわな（意訳）といった返事を頂きましたが、Ex4-Ex6プライマーで増やしたPCR産物をテンプレートにEx4-Ex5'プライマーでPCRをかけると、目的サイズのバンドが出ます。3000ギルド下さい。 上記、もちろん嘘です。いや、正直に書けば、どっちが固定観念に固執してんだよ、クローニングで得られた配列はそのcDNA中に無いっていう話に固執してるのはそっちだろ、と最初は思ってしまいました。しかし、プライマーもPCR条件も妥当とするならば、配列が間違っている可能性を考えるのは至って当たり前のことですね。今回はたまたま自分が既にPCRの結果を知っていましたが、これがなくとも私は疑いもせずにいたかもしれません。 >うさん はっきり申し上げれば、確かに私はあなたの回答が苦手です。すくなくとも最初の三つの回答は、抽象的で具体的にこうしてみたら？というのが読み取れない文章だったからです（少なくとも私にとっては、です。私の読解力の問題なのか・・・。toyoさんから頂いた返事の内容をうさんが既に私が書いたと言われたときにも？？？でした）。PCRの条件を変えろと言っているのか、プライマーを設計し直せといっているのか、どっちつかずですし、特に最初に頂いた回答は、「上記のことを考えれば、自ずとわかるはずでしょ？」的な結びで終わっているのに、わかりませんと私が回答しても、さらにどっちつかずの返事。見えないスメアの話も含めて、具体的な話がちっとも見えてこない回答は確かに私は苦手です。 しかし、科学の議論というのは好き嫌いでやるものではないでしょう。そもそも、好き嫌いの話をするならば私はAPさんの方がよっぽど気に入りません（上記参照）。しかし、言っていることに理屈が通っているならば、それを聞かないというのは間違っていると思うのです。それこそ、うさんが仰る通り「良いアドバイスであっても聞き逃すこと」になります。なので、私は私の能力で理解できない件については、わからないから教えていただけませんか？と書いているつもりであり、また、私は相手を黙らせたいなどと思って返事を書いているわけではないのです。もし、今後なにか気づいたことがあれば、是非とも書き込みをよろしくお願いします。 >あああさん SNPsに関しては正直全く考えていませんでした。今後はこれにも気をつけます。ありがとうございました。 >お粗末君さま いいかげんな推測、と書かれていますが、私も同じようなことが有効だったりしないかと考えていました。cDNAに余裕が出来たら試してみます。

(無題) 削除/引用 No.180-53 - 2012/02/23 (木) 16:09:07 - aaaa primerの設計を変更してはどうでしょうか？ G'がGより100bpも長いのでしたら、Exon5'の配列中にForwardまたはReverseどちらかを設計するよりも、100bpに前後2-3塩基オーバーラップするようなprimerセットを設計する方が良いと思います。もちろん、Gとは3'末端がアニールしないようにオーバーラップさせないといけませんが。

(無題) 削除/引用 No.180-52 - 2012/02/23 (木) 16:02:28 - 通りがかり それならもう「5'プライマーを沢山作って」「cDNAで試す」しかないんじゃないですか？ 5'プライマーで増えてるときって、鋳型となるDNAが多量にある時だけじゃないですか。 （いくらプラスミドを薄めて加えたからといってpgもcDNAにあるとは思えません） 5'プライマーで増えてるときって、鋳型となるDNAが多量にある時だけじゃないですか。 この疑問には今まで沢山やられている実験結果から考えて、どう思われるのでしょうか？ それだけを聞きたいです。

(無題) 削除/引用 No.180-51 - 2012/02/23 (木) 15:54:22 - Q 今回の質問を考える上で、最も重要でかつ意義のある実験結果であると思われることを最初に提示せずに、今頃後だしで「既に試した」とは一体PCRさんは何を考えていらっしゃるのか甚だ疑問です。 回答する人に、そこまで思いつくかなとでも試しているのでしょうか？そうでなくても、この一連の質問仕方とやり取りは、はっきり言ってPCRさんはご自分では築いていないようですが、甚だ失礼な話です。 考える気が失せますし、もう勝手にしてって感じです。そのくせ、「こういう提案をしていただけるとありがたい」とは片腹痛いです。よくわからない現象が起きる原因は、PCRさんにあるのでは無いかというのが私の率直な感想です。 もうアドバイスする気になる人いないんじゃないでしょうか。

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