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(無題) 削除/引用 No.1690-13 - 2013/04/30 (火) 15:35:10 - pcr-lock qPCR様 わかりやすい説明ありがとうございます。 > 最初の質問に答えるべきでしたね。 > > >質問は、「リアルタイムＰＣＲ測定において、同じ濃度でもプライマーが異なるとCPが異なるのは問題ないのですか？」ということです。 > > ちゃんとコントロール（この場合、検量線用のサンプル）をとっているなら、 > 問題ないです。 ありがとうございます。 すっきりしました。 これまで学部時代を含め約2年間、毎日リアルタイムPCRをやり続けていますが 同じサンプル、同じプライマー、同じスタンダードを使っても再現性のあるデータがとれていません・・・。 ご指摘のとおり、コントロールを取っているのですが・・・。 今回、スタンダードを新しく作り直し、これから新たに実験を組んでいるところで 同じミスを繰り返さないためにも、と思ってリアルタイムＰＣＲの原理から学びなおしているのですが 頭が悪くていろいろ考えすぎて、混乱しています。 本当にありがとうございます。 > >これは、つまりスタンダードと定量したいサンプルは同じ長さのものを用意すべき、ということですか？ > > いいえ。 了解しました。 > ちなみに、CPはCrossing Pointだと思いますよ。 > 他の会社では、Ct値とも言いますが。 > 重ね重ねすみません。。ありがとうございます。 >

(無題) 削除/引用 No.1690-12 - 2013/04/30 (火) 15:25:29 - pcr-lock おお様 私の知的レベルが低すぎて不快な思いをさせてしまいもうしわけありません。 >[Re:10] おおさんは書きました : > スタンダードを違うプライまーセット、遺伝子でとるのは全く意味をなさないはずですが、、、 > まったく意味をなさない・・ということですが・・・ すみません、説明願えますでしょうか？ 私の実験系は 「ある核酸サンプルをいろいろな条件下で反応させ、その産物をリアルタイムＰＣＲで定量する実験を行う予定です。 産物の質的な出来具合を見るために数種類のプライマーセットで測定し比較する予定です。」 です。（ざっくりですが） 今は作ったスタンダードがそれぞれのプライマーセットで反応するか、その条件をajdustしている段階です。 私の説明不足でしたら申し訳ありません。 > 同じ長さならいいってなんでいえるんですか?せっかく配列が違うと蛍光の強さが異なるという文献示したのに。。。 すみません。同じ長さならいい、と思っていたわけではありません。 そのように読み取れてしまうような文章を書いてしまい申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.1690-11 - 2013/04/30 (火) 15:13:45 - qPCR すみません、肝心な部分で書き間違いを・・・ > なお、同じPCR反応プレート内で、検量線をもとに「○○コピー数」と値を求めるのなら、まったく問題無いです。 > 絶対定量測定するためのプラスミドを用いて、検量線を使っているのなら、 PCR反応プレートが違っていても、コピー数を求める事が出来ます。 ただし、各反応プレートごとに、 検量線用のスタンダードサンプルと一緒にPCR反応させる必要はありますが。 最初の質問に答えるべきでしたね。 >質問は、「リアルタイムＰＣＲ測定において、同じ濃度でもプライマーが異なるとCPが異なるのは問題ないのですか？」ということです。 ちゃんとコントロール（この場合、検量線用のサンプル）をとっているなら、 問題ないです。 >これは、つまりスタンダードと定量したいサンプルは同じ長さのものを用意すべき、ということですか？ いいえ。 ちなみに、CPはCrossing Pointだと思いますよ。 他の会社では、Ct値とも言いますが。

(無題) 削除/引用 No.1690-10 - 2013/04/30 (火) 15:12:29 - おお スタンダードを違うプライまーセット、遺伝子でとるのは全く意味をなさないはずですが、、、 同じ長さならいいってなんでいえるんですか?せっかく配列が違うと蛍光の強さが異なるという文献示したのに。。。

(無題) 削除/引用 No.1690-9 - 2013/04/30 (火) 13:58:16 - pcr-lock R様、おお様、qPCR様 ありがとうございます。 すみません。ＣＰはカットオフポイントのことです。 >[Re:8] qPCRさんは書きました : > SYBR使っているのなら、 > 例えば、PCR産物がそれぞれ50bpと200bpでは、 > 同じ蛍光強度になるのに、理論上は２サイクル違ってきますよね。 > これは、つまりスタンダードと定量したいサンプルは同じ長さのものを用意すべき、ということですか？ > なお、同じPCR反応プレート内で、検量線をもとに「○○コピー数」と値を求めるのなら、まったく問題無いです。 > 実は条件の数によっては、定量PCRをワンプレートで計測できないことがあります。（うちのlight cyclerはn=32) なのでどうしても計測が別実験になってしまうことがあり、 これまでは何も考えずに、それぞれの計測で求まったコピー数を比較していましたが、それはよくないということに気づきました。 別計測でもコピー数を単純比較できるようにするには ・スタンダードのカットオフポイント（たとえば100KはCP=25と決める）が一定になるように検量線を作る ・増幅効率が一定になるように検量線を作る ・そもそもそんなこと無理 どれが適切でしょうか？ すみません… 御回答いただいているのに自分の頭がついて行けず、混乱しています。 本当にすみません。

(無題) 削除/引用 No.1690-8 - 2013/04/30 (火) 13:33:40 - qPCR SYBR使っているのなら、 例えば、PCR産物がそれぞれ50bpと200bpでは、 同じ蛍光強度になるのに、理論上は２サイクル違ってきますよね。 あと、thresholdの引き方によっても、かなり変わってきます。 もし、qPCRソフトが、 >ちなみに、検量線は「minimize error」ボタンで決めています。 >これで検量線のエラーが最少になるthresholdが決めることができます。 で、そのthresholdから値（CP値？）を求めているのなら、 >CPは「ある一定の蛍光を発するようになるサイクル数」と理解しています。 この解釈は、間違っている事になります。 なお、同じPCR反応プレート内で、検量線をもとに「○○コピー数」と値を求めるのなら、まったく問題無いです。 あと大体想像は付きますが、CPってなんでしょうか？ あるメーカー内だけで通じる勝手な略語は、こういった場では、使わない方が良いですよ。

(無題) 削除/引用 No.1690-7 - 2013/04/30 (火) 13:30:41 - おお The data show that SG exhibits sequence-specific binding, in particular at dbprs above ∼0.2.

(無題) 削除/引用 No.1690-6 - 2013/04/30 (火) 13:20:40 - R プライマーが異なれば、増幅効率に影響します。 ですので、プライマーセットAでは〜〜だった、プライマーセットBでは〜〜だっとなり、直接の比較はできません。 ただ、増幅効率が等しければ、CPが異なってもスタンダードを用いての定量結果は同じになるはずです。

(無題) 削除/引用 No.1690-5 - 2013/04/30 (火) 13:15:42 - pcr-lock おお様 ありがとうございます。 論文のアブストを読ませていただきました。 ssDNAとdsDNAではsyber greenの反応性が異なる、という内容で間違いないでしょうか？ 今後、実際のサンプルを使うようになったときには考慮して実験したいと思います。（スタンダードはdsDNA,サンプルはssDNAの予定です）

(無題) 削除/引用 No.1690-4 - 2013/04/30 (火) 13:09:07 - pcr-lock R様 コメントありがとうございます。 スタンダードの結果ですが、10^5,10^6,10^7,10^8コピーの4点で測定したところ、増幅曲線も等間隔で、検量線もきれいにひけました。 ちなみに、検量線は「minimize error」ボタンで決めています。 これで検量線のエラーが最少になるthresholdが決めることができます。 もしプライマーが違ってもCPが同じであるべきならば 検量線を作る時の目安をCPにしたほうがいいのか、ということも悩んでいます。

(無題) 削除/引用 No.1690-3 - 2013/04/30 (火) 13:06:15 - おお http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC484200/

(無題) 削除/引用 No.1690-2 - 2013/04/30 (火) 13:02:30 - R スタンダードでの定量結果はどうだったのでしょうか。

real time PCR.プライマーが変わると同じ濃度でもCPが変わる? 削除/引用 No.1690-1 - 2013/04/30 (火) 12:47:08 - pcr-lock はじめまして。 大学院修士2年目の初心者ですが、よろしくお願いします。 質問は、「リアルタイムＰＣＲ測定において、同じ濃度でもプライマーが異なるとCPが異なるのは問題ないのですか？」ということです。 かなり頭が混乱しています。。 ちんぷんかんぷんなことを言っていたら、ご指摘いただけるとありがたいです。 ある核酸サンプルをいろいろな条件下で反応させ、その産物をリアルタイムＰＣＲで定量する実験を行う予定です。 産物の質的な出来具合を見るために数種類のプライマーセットで測定し比較する予定です。 まず絶対定量測定するためのスタンダードを作りました（すべてのプライマーセットが反応できるもの）。 今このスタンダードをサンプルとして、それぞれのプライマーセットごとにアニーリング温度やマグネシウム濃度の条件検討を行っています。 リアルタイムＰＣＲの測定はRocheのRight cyclerのcyber greenで、software4.1で解析をしています。 そこで最初にも書いた質問なのですが、 プライマーが異なると同じ濃度でもCPが異なるのはなぜですか？ CPは「ある一定の蛍光を発するようになるサイクル数」と理解しています。 同じ濃度でもCPが低いときと高いときがある場合、その違いはプライマーの増幅効率だと思っています。 しかし今、増幅効率が同じでもプライマーが異なるとCPが10くらい違うという結果が出ています。 これはなぜなのでしょうか？ みなさまお忙しいところ申し訳ありませんが、お知恵を貸していただけると助かります。 あるいは「ここをみて勉強しろ」というのでもかまいません！ 宜しくお願いします。

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