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(無題) 削除/引用 No.1678-16 - 2013/04/26 (金) 21:43:15 - ttt 顕微鏡的にと言っても、その小器官というのがERだったりすれば、細胞質へ移行した蛋白と形態的に見分けるのは無理なんでしょうね。 もし、その蛋白が膜タンパクであればsubcellular fractionationでかなり信頼性の高い結果が得られると思いますが、ERのlumenに存在する可溶性蛋白であればHomogenizationを慎重にしないと漏れでて来て有意差を見るのが難しいかも知れません。 細胞質に特定の配列を認識・修飾する蛋白を発現させて、目的の蛋白をその配列で標識して、その配列が修飾されるかどうかで細胞質の局在を見る、という方法もありますか。例えばBirAによるbiotinylationとか。

(無題) 削除/引用 No.1678-15 - 2013/04/26 (金) 19:20:44 - 独り言 >[Re:13] 中西部ポスドクさんは書きました : > 私の実験で見られている現象は頻度があまり高くなく（数％）、かつ全ての蛋白質がオルガネラから細胞質に移動する訳ではないのでかなり見にくいのです。 定量方法にもよるけど、免疫染色だとその数％意外の細胞では細胞質に移動したタンパク質がほぼ０にカウントされてしまうとおもう（わずかにいっていたとしても）。 生化学的に膜分画と細胞質分画を調べれば良いと思う。

(無題) 削除/引用 No.1678-14 - 2013/04/26 (金) 14:47:57 - ttt すみません。わたしの思い違いだったようです。FPPという手技ですが、生細胞のジギトニン処理で細胞膜を透過処理した場合は細胞質の蛋白が10-60秒で拡散すると書いてました。この手技の目的は小器官の蛋白のトポロジーを決めるためのものなので、細胞質蛋白の拡散は問題無いんですね。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3018527/ 「局在変化」ということは、「細胞質にも小器官内にも一定量が局在してる」というのではなく、何らかの刺激で移行するということで良いのでしょうか？ もし全部でなくても、そこそこの量の蛋白が移行するのであれば、逆に透過処理した生細胞から漏れでてきたものを検出して刺激の有無で比較するとかは無理そうでしょうか？　 まあ、でも局在変化だったら個人的には顕微鏡的に観察するのが一番説得力があるような気がしますが。蛍光蛋白とのfusionが野生型と同様な挙動をするなら手っ取り早いんでしょうけどね。

(無題) 削除/引用 No.1678-13 - 2013/04/26 (金) 13:30:47 - 中西部ポスドク 皆様ありがとうございます。ラボの中ではあまり意見が出ませんでしたので、大変参考になります。 まず蛍光顕微鏡での観察をしてみようと思います。 PFA固定後の遠心等も避けられますので。 ttt様の文献、もし情報がありましたらご教授頂けますと幸いです。 私の実験で見られている現象は頻度があまり高くなく（数％）、かつ全ての蛋白質がオルガネラから細胞質に移動する訳ではないのでかなり見にくいのです。そこでジギトニンを使ったFCMが応用出来ないかと考えております。もしどなたかさらなるアイディアがありましたら宜しくお願い致します。

訂正 削除/引用 No.1678-12 - 2013/04/26 (金) 08:26:26 - ttt 引用が上手く行かなかったようです。 　 下のレスの一行目は引用部分です。

(無題) 削除/引用 No.1678-11 - 2013/04/26 (金) 08:25:21 - ttt 先に染めるにしても細胞に穴をあけると細胞質の蛋白は流出してしまうのではないでしょうか？ 濃度が適切であれば生細胞をジギトニン処理しても大丈夫そうですけどね。少し前の比較的有名ジャーナルに出てたような気がします。

(無題) 削除/引用 No.1678-10 - 2013/04/25 (木) 20:16:03 - mon >[Re:6] ななしさんは書きました : > B/F分離をどうするんだろうということですが 蛍光顕微鏡で観れば良いのでは？

(無題) 削除/引用 No.1678-9 - 2013/04/25 (木) 19:24:00 - flow joe >あるオルガネラから細胞質内へ局在が変わるのを示す為に と書いおられますが、FCMは基本的には蛍光量を測定するので、事実として差が生じるならともかく、GFP complementation assayやFRETの利用を考えないとならないと思います。それにしても顕微鏡観察は必須だとおもいますし。 PFA固定に関してですが、浮遊細胞の場合washで遠心をすることが多いですので固定されて柔軟性が落ちた膜はダメージを受けやすくなります。遠心条件やピペッティングも慎重にする必要があります。Cell lineにもよるとは思いますが、単純な操作ではなくテクニックを磨く必要もあります。

(無題) 削除/引用 No.1678-8 - 2013/04/25 (木) 14:57:24 - 774 これはTATペプチドですか？？？ ＞No.1678-4 - 2013/04/25 (木) 11:20:36 - mon ＞抗体を細胞内に導入する試薬は使えないかな？

(無題) 削除/引用 No.1678-7 - 2013/04/25 (木) 13:53:45 - 中西部ポスドク 皆様御知恵をありがとうございます。 flow joeさま、おおさま、蛍光顕微鏡試してみたいと思いますが、抗体のクオリティはICCの結果かなり良い事を確認しており、無処理の細胞がTriton処理よりは弱いもののはっきりと染色されていてジギトニン処理と大差ないことからPFA処理による膜へのダメージを疑って入るのです。先に染めるにしても細胞に穴をあけると細胞質の蛋白は流出してしまうのではないでしょうか？ monさま、ななしさま、面白い試薬をありがとうございます。これは、と思ったのですが、確かにB/F分離できないですね。でも大変参考になりました。 もしどなたか、よりよい固定方法（固定はしっかりしているけれども膜にはダメージを与えず、細胞内局在も変えない）等ご存知でしたら御指導お願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1678-6 - 2013/04/25 (木) 11:39:37 - ななし B/F分離をどうするんだろうということですが

(無題) 削除/引用 No.1678-5 - 2013/04/25 (木) 11:37:19 - ななし これ使うとすべての細胞が陽性にならないかな？ ＞No.1678-4 - 2013/04/25 (木) 11:20:36 - mon ＞抗体を細胞内に導入する試薬は使えないかな？

(無題) 削除/引用 No.1678-4 - 2013/04/25 (木) 11:20:36 - mon 抗体を細胞内に導入する試薬は使えないかな？ http://protenova.com/ab_carrier_1.html

(無題) 削除/引用 No.1678-3 - 2013/04/25 (木) 10:46:56 - おお PFA処理した段階で膜は可也ダメージを受けていると思います。デタージェント処理のように溶けているわけではないですが、抗体などの透過性もあるくらいダメージがあるのではないかとおもいます。実際よく染まる抗体ではPFA処理だけでデタージェントがなくてもそまります(もちろん細胞内のタンパクの話です)。 抗体を反応させてから固定するという話もききますが。。。

(無題) 削除/引用 No.1678-2 - 2013/04/25 (木) 09:28:23 - flow joe 蛍光顕微鏡でチェックしてからFCMで計数っていうのが確実かつ蛍光顕微鏡像も得られて良いです。ネガコンのシグナルもノンスペなのか膜透過性によるものなのか判断できます。

FACSでのジギトニンを用いた蛋白局在解析 削除/引用 No.1678-1 - 2013/04/25 (木) 06:34:54 - 中西部ポスドク いつも参考にさせて頂いております。 現在とある蛋白質の細胞内局在変化をFACSで検出できないか検討しております。 あるオルガネラから細胞質内へ局在が変わるのを示す為に 4%PFAで室温10分で固定後100ug/mlのジギトニンで10分処理し、細胞膜のみに穴を開けた後抗体で処理してFACSしているのですが、ネガティブコントロールとしておいたジギトニン未処理の細胞でも染色が見られております。コントロールとして用いているcytochrome cも染色陽性です。ポジティブコントロールとしておいているTritonX100処理の細胞に比べるとやや蛍光は弱いのですが、明らかに染色されています。 期待しているのは透過性処理をしていない細胞ではネガティブ、ジギトニン処理細胞では局在が変わった蛋白だけ陽性（cytochrome cのように）、TritonX100処理細胞では全ての細胞が陽性、という結果ですがほど遠いのが現状です。 どなたか同様の実験の経験、類似の実験もしくはプロトコールをご存知の方はいらっしゃらないでしょうか？

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