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(無題) 削除/引用 No.1676-14 - 2013/04/26 (金) 14:17:47 - marimo 774さま　おおさま ありがとうございました。 Ｙ２Ｈもありなのですね（？）しかし直接的相互作用を見ているとは限らないとのおおさまのご意見もあり、難しいのですね。 今はpull down assayに傾いているのですが、自作が必要なタンパクの合成＆精製、その後のアッセイに関してももっと深く流れを考えて行う必要があるようです。 Ｙ２Ｈの実験もラボに行う系があるか調べてみます。 貴重なご意見、ありがとうございました。 いつもとても参考になります。そして自分は本当に不勉強だなーと痛感いたします。

(無題) 削除/引用 No.1676-13 - 2013/04/26 (金) 08:43:53 - おお >[Re:12] 774さんは書きました : > IPのデータがあって、もう一つ別の方法で確認しながらダイレクトか調べろ、と言われているんですよね。 > IPがあるならtwo hybridでいい気がするのですが。なにかダメな要素がありますか？ わたしの述べた例は核タンパクで、イーストでもほぼ全くといって良いタンパク質複合体の構成でワークしているものでした。その構成されている一部のたんぱく質をコードする遺伝子のKO株はヒトの相当する遺伝子でレスキューされます。なのでイーストのなかでヒト遺伝子は産物がその複合体をとる可能性をかんがえると、間接的結合はひていできなかったからです。 たとえばMAPKなどのカスケードはイーストのKOをマンマルの遺伝子でレスキューできます。イーストでヒト遺伝子がこの様に機能するなら、それに関係する複合体ができているわけで、そういう複合たいの一部を形成しながらレポーターの遺伝子をONにしている可能性を排除できなくなるので、直接のインターラクションというにはよわいというかんがえかたです。 もちろんイーストのtwo hybridのシステムはうたい文句としては直接的相互作用をみれるとなっているとおもいますが、かといって、直接的相互作用をみているとは限らないのではないかということです。 ただちょっと考え過ぎなのかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.1676-12 - 2013/04/25 (木) 18:10:20 - 774 IPのデータがあって、もう一つ別の方法で確認しながらダイレクトか調べろ、と言われているんですよね。 IPがあるならtwo hybridでいい気がするのですが。なにかダメな要素がありますか？

(無題) 削除/引用 No.1676-11 - 2013/04/25 (木) 15:37:57 - おお >[Re:10] 774さんは書きました : > two hybridでもいいのでは？ イーストですよね。。。それは厳しく突っ込む人がいるかもしれません。見てる蛋白にもよるかもしれませんけど、、、というか厳しく突っ込んだことがあります。そうこういっているうちに違うグループがin vitro translationを添えてペーパーだしてたり、、、in vitro translationもバクテリアライせーとならまだいいですけど、レティキュロサイトなら微妙、、、まあtwo hybridと合わせ技ならってところでしょうけど(主張によっては). バクテリアのtwo hybridのシステムもありましたよね。。。はやってないかな。

(無題) 削除/引用 No.1676-10 - 2013/04/25 (木) 14:40:22 - 774 two hybridでもいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.1676-9 - 2013/04/25 (木) 13:28:13 - marimo ぽにょさま ありがとうございました。 この方法も参考文献を見ていた時に知ったのですが、機械がないとできなさそうですよね？ ラベル法も教えていただきありがとうございました。参考になりました。 当方ラベルの実験をしたことがないため、どの程度難しいのか分らないので経験者に聞いてみます。 ご回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1676-8 - 2013/04/25 (木) 07:51:06 - ぽにょ もうちょっと近年の手法では、Biacoreを使うという手もありますね。

(無題) 削除/引用 No.1676-7 - 2013/04/25 (木) 07:01:30 - ぽにょ 当方はこういう目的の実験をした事が無いのですが、思いついた方法があるので、、、 片方のタンパクをメンブレンにドットブロットして、もう片方を何か標識して反応させて検出するのでは駄目ですか？ 古典的な方法としては、125IをクロラミンT法か酵素法などで標識。結合反応、洗浄、メンブレンを切り出し、ガンマカウンタで測定。 いずれにせよ、条件検討は必要ですけど。

(無題) 削除/引用 No.1676-6 - 2013/04/25 (木) 03:02:50 - おお >[Re:5] marimoさんは書きました : > 293Tなどにタンパク質を過剰発現させると、核抽出物でもwhole cell extractでも100〜数100μgとれるのですが、これっておかしいのでしょうか？濃度を測り、inputはいつも10〜50μg程のせています。IPには数100μg使い、今回相互作用を見たいタンパク質のIPではbufferはかなり弱い条件のものを使いました。 いやその中にふくまれる目的のたんぱく質の量です。

(無題) 削除/引用 No.1676-5 - 2013/04/24 (水) 23:23:25 - marimo おおさま ご回答ありがとうございました。勉強になることばかりです。 精製度はあまり問題にならないのではというお話や、ファーウェスタンの弱点(ポジコンの設定など)を教えていただき、今はpull down assayをやってみようかとかたむいています。 293Tなどにタンパク質を過剰発現させると、核抽出物でもwhole cell extractでも100〜数100μgとれるのですが、これっておかしいのでしょうか？濃度を測り、inputはいつも10〜50μg程のせています。IPには数100μg使い、今回相互作用を見たいタンパク質のIPではbufferはかなり弱い条件のものを使いました。 とにかく量を多くしておけばなんとかなるのではないか、ということで参考にした論文などでは使用タンパク質量が多かったのかもしれません(おおさまのおっしゃられていたように)。 どちらの実験にしてもノウハウを知る人が身近にいないため、かなり手探りでの実験となりそうです。また質問をさせていただくかと思います。 おおさま、本当にありがとうございました。とても参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.1676-4 - 2013/04/24 (水) 17:20:45 - おお バクテリアで作るなら精製度は一般的にはそんなに大きな問題にはならないとおもいます。というのはそのほかのマンマルのたんぱく質がバクテリアにないからです。まあ、きれいにこしたことはないのですが、、、 10ugということですが、実際に細胞でIPする時に10ugも取れてますか?ファーウエスタンで、ターゲットの量が10ugになるほどタンパクを乗せれますか? 多く乗せた方が検出は楽になります。あと直接相互作用するとしても安定なコンプレックスでない場合もありますでしょうから無難な量として多い設定があるともいえるかもしれません。実験によってはそれぐらいの量用意してこうたいじゃなくってCBB染色で検出しているようなものもありますから、そういう実験にも使えるぐらいのプロトコール、システムを用意しているのだと思います。 もう一つはリコンビナントをバクテリアから精製したとして、全部ちゃんとフォールティングしているだろうかかんがえるなら、えられたタンパクの一部が必要なフォールディングを完成しているばあいでも多くのせれば検出が可能になるということもあり得る妥当と思います。どんな蛋白でも活性がはかれてフォールディングを確認できるわけではないですから。 まあGSTの方の消費をおさえたいのなら、まずはファーウエスタンから始めても良いでしょうけど、あまりそこで条件がどうのこうのとやっていると間に合わないかもしれません(結構条件ぎめとかやらないといけない方法かなあと思いますので)し、ポジコンが設定しにくい(できたとしても、あなたのタンパク同士お相互作用のポジこんでない)方法でもあるので、何かと手探りになるかと思います(参考にしたプロトコールで発表可能といえるようなデーターが出なければ)。

(無題) 削除/引用 No.1676-3 - 2013/04/24 (水) 16:30:39 - marimo おおさま ご回答ありがとうございました。 理論が大丈夫とのことで安心しました。 またプルダウンアッセイのお話もありがとうございます。 「HisタグだとGSTに比べて回収率が悪いからなー」という話を聞いたことがあるので、Hisタグだから回収率が悪いのだと思っていました。 pull down assayを行うなら研究室にある（別の用途で先輩が購入していた）promegaのMagneGST Pull-down systemを使おうと思っております。 このキットを使ってpull down assayをしている論文を読んだところタンパク質を10ugほど使っていたので、精製度＆回収量がとっても悪い今のHisタグタンパクで実験がうまくいくのだろうかと考えておりました。 量は何回か回収すればそれなりの量になるとは思うのですが、精製度が悪いタンパク質でも大丈夫なものでしょうか？ やってみないことには何も始まらないのですが、購入したタンパク質（←高い）の量に限りがあるため、できる限り多くの情報を集めてから実験を行いたいと思い質問させていただきました。 重ねての質問となり申し訳ありません、お時間のある時にでもご教示いただけたらと思います。

(無題) 削除/引用 No.1676-2 - 2013/04/24 (水) 15:35:38 - おお > > そこで参考書を見ていたらfar western法を見つけ、「例えば２９３ＴにＢをover expression させてタンパク質を回収・泳動し、購入したGSTタグ付きのＡをbaitとして使ったらいいのではないか」と考えたのですが、この実験は妥当なものでしょうか？ 理論的にはそれでOKだとおもいます。テクニカルな難易度はたかいかもしれませんし、一度変性させているというところが障害になるかもしれません。 > 片方のタンパク質（Ａとします）はGSTタグ付きのものが売られていたので購入したのですが、もう片方のタンパク質（Ｂとします）は自作するしかなく、Hisタグ故に非常に回収量が少なく実験ができそうにありません Hisタグだから回収率が悪いというりろんがよくわかりません。量的には抗体で検出できればいいわけだから一回のプルダウンに1ugもいりませんよね。

far-western 法について 削除/引用 No.1676-1 - 2013/04/24 (水) 14:56:31 - marimo いつも勉強させていただいています。 現在「vitroでタンパク質ータンパク質のdirect bindingを確認するように」と言われ実験を行っているのですが、GST pull down assayと同じくfar western法もタンパク質同士の直接結合を見ていると考えていいのでしょうか？ 投稿した論文にIPのデータを入れたのですが、そのデータに関して「ほんとに２種のタンパクが直接結合しているのか例えばGST pull down assayで確認するように」とreviewerからコメントが来たという状況です。 片方のタンパク質（Ａとします）はGSTタグ付きのものが売られていたので購入したのですが、もう片方のタンパク質（Ｂとします）は自作するしかなく、Hisタグ故に非常に回収量が少なく実験ができそうにありません。 そこで参考書を見ていたらfar western法を見つけ、「例えば２９３ＴにＢをover expression させてタンパク質を回収・泳動し、購入したGSTタグ付きのＡをbaitとして使ったらいいのではないか」と考えたのですが、この実験は妥当なものでしょうか？ 身近にこの実験をした人が誰もいないため、妥当性も判断できず、またreviewerのコメントにきちんと答えられている実験なのかも判断できず困っております。 経験者の方にご教示いただけたらと思い、投稿させていただきました。 よろしくお願いいたします。

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