Bio Technical フォーラム

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50bpのDNA断片をベクターに組み込みたい トピック削除
No.1674-TOPIC - 2013/04/24 (水) 09:16:27 - UC
いつも勉強させてもらっています。
タイトルの件ですが、ある制限酵素で処理すると、酵素認識部位を
中心に両端は4bpのsticky-endでDNA断片を切り出します。長さは
50bpぐらいです。この切り出された断片をSangerシークエンスしたいのですが
この両端の塩基配列は、ランダム（実は中心の認識配列以外はランダム）です。

5'-NNNNNNNNNN....NNNN -3'
3' NNNNNN....NNNNNNNN -5'

100bp以上あるならば、何とかSangerで、とは思いますが短い断片です。
末端の塩基が既知ならば、定石通り、ベクターも対応する配列で切り出して
組み込んでシークエンスすれば良いと思いますが、この場合は、何かうまい
方法がありますか？
思いついたのは、末端4塩基はKlenowか、T4 DNA polymeraseで平滑化して
ベクター側もblunt-endにしてligationという流れですが、これでうまくいくか
どうか分かりません。因みに、大腸菌を扱える施設ではないため、クローニング
などは出来ないので、ベクター(手持ちにpGL3Basicあり)に組み込ませた後は
ベクター側のプライマーでPCRしてゲルで切り出して、シークエンスしてみよう
と思っています。
何かアドバイスなどいただけたらと思います。
　
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(無題) 削除/引用
No.1674-5 - 2013/04/24 (水) 14:19:18 - おお
突出リンカーをNじゃなくI(イノシン)にしたらこうりつよくなるかな。。。ライゲーズが効くかちょっと調べてみないとわからないですけど、、、

Re: 削除/引用
No.1674-4 - 2013/04/24 (水) 13:02:19 - UC
おおさん、ご回答ありがとうございます。

>その切り出された配列は均一なはいれつですよね、、、
均一の意図するところが分かりかねますが、制限酵素の認識部位はユニークです
が、その周辺〜両端は何でもありで、50bp程度に切り出す特殊な制限酵素です。なので、Sangerで見てみると、周辺部位は塩基が入り乱れて全く読めない可能性
があります。その時は、次世代シークエンサーで1アンプリコン毎に読めばよいと
思っているので、とにかくベクターに組み込めればと思っている訳です。

でも考えてみたら、おおさんのご回答のように出来るということは、次世代シー
クエンサー用のアダプターでligation出来れば、そのまま次の工程に進めます
ねぇ。

(無題) 削除/引用
No.1674-3 - 2013/04/24 (水) 12:24:26 - おお
NNNN突出した T7プロモーターはいれつをももつリンカーをつくり、得られたフラグメントの数分の1の量をライゲーションして(なるべく両端にT7が来ないようにモル比で可也少な目にくわえる)、その後NNNN突出したSP6リンカーでライゲーション。T7、SP6でPCRすればどうかな、、、

(無題) 削除/引用
No.1674-2 - 2013/04/24 (水) 12:07:27 - おお
何とかコンカテマーをつくってPCRしたいところですね、、、ちょっとかんがえてみます。

それか、切り取る前の配列からはあぷろーちできないのかな、、、その切り出された配列は均一なはいれつですよね、、、

50bpのDNA断片をベクターに組み込みたい 削除/引用
No.1674-1 - 2013/04/24 (水) 09:16:27 - UC
いつも勉強させてもらっています。
タイトルの件ですが、ある制限酵素で処理すると、酵素認識部位を
中心に両端は4bpのsticky-endでDNA断片を切り出します。長さは
50bpぐらいです。この切り出された断片をSangerシークエンスしたいのですが
この両端の塩基配列は、ランダム（実は中心の認識配列以外はランダム）です。

5'-NNNNNNNNNN....NNNN -3'
3' NNNNNN....NNNNNNNN -5'

100bp以上あるならば、何とかSangerで、とは思いますが短い断片です。
末端の塩基が既知ならば、定石通り、ベクターも対応する配列で切り出して
組み込んでシークエンスすれば良いと思いますが、この場合は、何かうまい
方法がありますか？
思いついたのは、末端4塩基はKlenowか、T4 DNA polymeraseで平滑化して
ベクター側もblunt-endにしてligationという流れですが、これでうまくいくか
どうか分かりません。因みに、大腸菌を扱える施設ではないため、クローニング
などは出来ないので、ベクター(手持ちにpGL3Basicあり)に組み込ませた後は
ベクター側のプライマーでPCRしてゲルで切り出して、シークエンスしてみよう
と思っています。
何かアドバイスなどいただけたらと思います。
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