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LPS刺激によるTHP-1細胞のTNF-α産生 トピック削除
No.1669-TOPIC - 2013/04/22 (月) 22:46:17 - qr

初投稿のため、至らない点もあるかと思いますが
どうぞよろしくお願いいたします。


現在、ELISAキットを用いたTNF-α産生量の測定を行っています。
しかし、LPSを添加してもTNF-αが十分に産生されません。

実験方法は以下のとおりです。


・培養したTHP-1細胞(10%FBS含有RPMI1640培地)を3×10^5cell/mlに調製
・24wellに450µlずつ播種
・3日間培養
・LPS(1.1µg/ml)を50µl添加
・8時間培養
・ヒトTNF-αELISAキットで測定


試しにLPSの添加量を増やしてみたところTNF-α量も増加しましたが、
以前のデータ(過去3回)より明らかに減少しています。
以前はLPS刺激無しのTNF-α量の4倍前後ありましたが、
1.5〜2倍程度の量しか産生されていませんでした。

細胞の状態や培地にも特に問題は無いようでしたし、
LPSも新しく購入したものを使用しました。

操作ミスの可能性も考えましたが
以前も同様の操作で何の問題も無く行えていました。


CD14やTLR4、MD-2などの発現についても調べていますが
私の力不足か、なかなか原因に繋がるような情報が得られません。


このような経験のある方、ヒントになるような論文をご存じの方、
ご助言いただけますと幸いです。
 
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9件 ( 1 〜 9 )  前 | 次  1/ 1. /1


おお さん 削除/引用
No.1669-9 - 2013/04/24 (水) 12:14:54 - qr

> 今回の実験は1回だけでしょうか?

これまでに7月、8月、9月、11月、1月にそれぞれ1回ずつ行い、
前半3回は問題無く行え、後半2回のデータが今回質問した結果となりました。

考えられる可能性としては、季節(気温)の関係でしょうか・・・?



> TNFがベーサルにあがってないなら、マイコの心配はなさそうですが、一度チェックをしておいた方がいいかもしれません。

はい、確認してみます。



> LPSは新しいものということですが、ロットがかわって細胞への影響が変わった可能性はないかなぁと漠然に思いましたが、前に使った分があるならちょっとためしてみても良いのではとおもいました。

そうできるといいのですが、これまでの分は使い切ってしまい
新しいものを試してみるしかない状況です。。。



> 毎回大きくぶれるようでしたら、実験系自体を改善する必要もあるかもしれませんね。

はい、培養時間や添加のタイミング、添加量なども検討してみようかと思います。

ただ、毎回大きくぶれるというよりは、低い状態のままという感じです。

最近の2回分のデータからの判断ではありますが、再現性の見られるサンプルも多くあったため
以後もこのような状態が続くのならば、これまでのデータとは別として
考えた方がいいのかもしれないと思っています。

しかし、LPS刺激ありとなしの差が以前よりも圧倒的に小さいため
この状態で評価してしまっていいものかとも悩んでいます。

alpha さん 削除/引用
No.1669-8 - 2013/04/24 (水) 11:31:17 - qr

> 細胞が死んでるんじゃないですか?

細胞生存率も測定しましたが、そちらには特に異常は見られませんでした。
もちろんLPS刺激を与えたものの生存率は下がりましたが、
これまでのデータと比較しても問題があるような数値ではありませんでした。


> もしくは、3日間の培養でLPSに対する応答性が変化したか。

その可能性もあるかもしれません。
細胞の観察のみではありますが、
3日間の培養前、培養後(LPS添加前)、LPS添加培養後の細胞に
形状の異常や収縮も特に見られませんでした。

その他の方法も検討してみようかと思います。


> 逆に質問なんですが、
> THP-1をLPSで刺激する系ってメジャーなんですか?
> マクロファージ様に分化させてLPSを作用する系はよく見かけますが。

メジャーかどうかまでは分かりかねますが
私もいくつかの論文を見たことはあります。
ただ、これまで問題が無かっただけあって悩んでいる状態です。

(無題) 削除/引用
No.1669-7 - 2013/04/24 (水) 08:57:59 - おお
メジャーかどうかより、目的しだいかと思いますが、以前にやってもっと高かったということなので、、、

今回の実験は1回だけでしょうか?

あとベーサルのレベルを聞いたのは、すでにTNFがupregulateされてないかどうか気になったからです。

TNFがベーサルにあがってないなら、マイコの心配はなさそうですが、一度チェックをしておいた方がいいかもしれません。

LPSは新しいものということですが、ロットがかわって細胞への影響が変わった可能性はないかなぁと漠然に思いましたが、前に使った分があるならちょっとためしてみても良いのではとおもいました。

毎回大きくぶれるようでしたら、実験系自体を改善する必要もあるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用
No.1669-6 - 2013/04/24 (水) 07:45:36 - alpha
細胞が死んでるんじゃないですか?
もしくは、3日間の培養でLPSに対する応答性が変化したか。

逆に質問なんですが、
THP-1をLPSで刺激する系ってメジャーなんですか?
マクロファージ様に分化させてLPSを作用する系はよく見かけますが。

訂正 削除/引用
No.1669-5 - 2013/04/23 (火) 00:51:38 - qr

実験方法の文字化けしてしまっている部分は
全て「マイクロ」です。

申し訳ありません。

早速のお返事ありがとうございます。 削除/引用
No.1669-4 - 2013/04/23 (火) 00:45:17 - qr

> 血清のロットはかわってますか?

これまでと同じものを使用しています。


> 今回使った細胞はどれくらいの期間けいだいをつづけていたもので、まえのものとどれくらい差があるのか

毎回、6代目か7代目(約3〜4週間の間)の細胞を使用しています。


> 2倍ぐらいしか上がらないとかいてますが、絶対値のべベーサル(すなわち刺激なしで)前と変化あるかどうかというのも重要な情報源と思いますが、、、

以前と今回の刺激無しのものを比較して、ということでしょうか?
何分勉強中のため、ご質問の意図を理解できていませんでしたら申し訳ありません。

これまでのデータと比較して、刺激無しのTNF-α量は少し減少傾向ではあったものの
差が大きいというほどではありませんでした。(素人判断ではありますが…)
そのためTNF-αの産生は変わらず行われているかと思います。
どちらかというと、LPSに対する感度が低下したような印象を受けました。

サンプル(植物抽出物)を添加した際にTNF-α量が急激に増加したものもあったため
TNF-α自体の産生はされているのではないかと考えています。

(無題) 削除/引用
No.1669-3 - 2013/04/22 (月) 23:12:30 - おお
血清のロットはかわってますか?

(無題) 削除/引用
No.1669-2 - 2013/04/22 (月) 23:09:44 - おお
ちょっと詳しいものではないですが、今回使った細胞はどれくらいの期間けいだいをつづけていたもので、まえのものとどれくらい差があるのかと、2倍ぐらいしか上がらないとかいてますが、絶対値のべベーサル(すなわち刺激なしで)前と変化あるかどうかというのも重要な情報源と思いますが、、、

LPS刺激によるTHP-1細胞のTNF-α産生 削除/引用
No.1669-1 - 2013/04/22 (月) 22:46:17 - qr

初投稿のため、至らない点もあるかと思いますが
どうぞよろしくお願いいたします。


現在、ELISAキットを用いたTNF-α産生量の測定を行っています。
しかし、LPSを添加してもTNF-αが十分に産生されません。

実験方法は以下のとおりです。


・培養したTHP-1細胞(10%FBS含有RPMI1640培地)を3×10^5cell/mlに調製
・24wellに450µlずつ播種
・3日間培養
・LPS(1.1µg/ml)を50µl添加
・8時間培養
・ヒトTNF-αELISAキットで測定


試しにLPSの添加量を増やしてみたところTNF-α量も増加しましたが、
以前のデータ(過去3回)より明らかに減少しています。
以前はLPS刺激無しのTNF-α量の4倍前後ありましたが、
1.5〜2倍程度の量しか産生されていませんでした。

細胞の状態や培地にも特に問題は無いようでしたし、
LPSも新しく購入したものを使用しました。

操作ミスの可能性も考えましたが
以前も同様の操作で何の問題も無く行えていました。


CD14やTLR4、MD-2などの発現についても調べていますが
私の力不足か、なかなか原因に繋がるような情報が得られません。


このような経験のある方、ヒントになるような論文をご存じの方、
ご助言いただけますと幸いです。

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