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(無題) 削除/引用 No.1656-16 - 2013/04/28 (日) 20:13:00 - ジムニー みなさまのお陰で解決できました。 次はサザンでの確認です。 暇な時に論文を拝見します。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1656-15 - 2013/04/28 (日) 17:24:21 - Real-time 解決できたのは何よりです。 私もジムニーさんと似たようなことしているので文献を探してみました。 Genome Res 1995 Vol.4 p368-p370 読んでみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1656-14 - 2013/04/23 (火) 13:30:19 - 7744 少ししかステップは減らせないし、すでにPCRが走っているので参考になるかわかりませんが、 SDSを含むプロK処理のあとに、ダイレクトにエタ沈でも大丈夫。 これだとSDSが全く入らないので安心だと思います。 まぁproK失活させたものダイレクトで安定してPCRが走るなら問題ないとは思いますが。 やはりSDSの混入でPCRが走りにくくなるのは間違いないので、個人的に少しでも入っているのは嫌です。 走ったサンプルは走ったということでいいと思いますが、走ってない場合に、必ずしも自信を持って「走らないサンプル」だとは言えない気がして・・・。 多少手間はかかっても、確かな結果を出すことが大事だと思います。

訂正 削除/引用 No.1656-13 - 2013/04/23 (火) 12:48:33 - くじら TEではなく、50 mM Tris-Cl(pH8.0)でした。

(無題) 削除/引用 No.1656-12 - 2013/04/23 (火) 11:04:30 - くじら 解決したっぽいですけど、 トランスジェニックマウスのタイピングの系が参考になるのではないでしょうか。参考資料いろいろあると思います。 しっぽをTE＋ProKにいれて55℃2−3時間、95℃10分　で そのままPCRテンプレートに使ってました。 ExTaqで2k弱を増やしてました。 しっぽは原型をとどめてますが、上記で融解できる柔らかい？細胞由来だけで PCRがかかってるような感じです。 培養細胞なんか、ちょこざいなって気がしますが、浅はかでしょうか・・？ あと、SDS の阻害を回避するならば、テンプレートを100倍くらい 薄めればあっさりかかるかもです。

(無題) 削除/引用 No.1656-11 - 2013/04/20 (土) 18:44:44 - ジムニー 助言を頂いたみなさま、ありがとうございました。 これで組換えポジの細胞を短時間でみつけられそうです。 フェノール抽出の煩わしさを回避できそうです！

(無題) 削除/引用 No.1656-10 - 2013/04/20 (土) 16:41:33 - おお おー、増やせたのですね。酵素の性能がたんなるタックよりもよくなってきているからでしょうかね。といってもLA-Taqはそんなに新しい酵素ではないですよね。。。とにかくおめでとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1656-9 - 2013/04/19 (金) 17:16:51 - ジムニー できました！ ProK処理後に失活させてLA-TaqでPCRをしたら3Kbのバンドを検出できました。 KOD-FXも持ってるので、機会があれば試してみます。 おおさんも助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1656-8 - 2013/04/19 (金) 14:53:26 - bluehornet TOYOBOのKOD FXやKOD FX neoはどうでしょう？ 手元にあるKOD FXの実施例集には「培養細胞からの増幅例」としてjurkat細胞の懸濁液を直接PCR mixtureに加えて8.5kbの増幅を行っています。 チェックをするだけなら継代の途中にサンプリングをしてすぐにPCRに持って行けると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.1656-7 - 2013/04/19 (金) 03:01:19 - おお きっと出なくというなら 比較的きれいになりそうで思いつくのは、SDS、PK処理をしてグアニジンやウレアをくわえ、1.5mlチューブのふたに透析まくがついたもので透析してやるという手があります。TEでとうせきするといいかとおもいます。エタチンしたいなら150mMのNaClをふくむTEでもいいかもしれません。PKをかまさないなら、透析の時にポアサイズの大きなものにするとかなりのタンパクは外に出ていきます。 透析がしっかりできていればそのままPCR可能だと思います。 もう一つはシリカ、グラスビーズやDiatomaceous EarthにDNAをくっつけてしまうほうほう。高いイオン強度(NaCl, LiCl, NaI, グアニジンなど)でlysisしてシリカをくわえればDNAはシリカなどについて遠心でたの成分とわけれます。アルコールなどで洗いTEなどでリカバーすればかなりきれいなDNAがとれます。 チュ-ブを変えるのはさいごのDNA溶液からシリカなどを遠心で除くときだけ。らんぼうかもしれませんが、遠心してシリカの入ったチューブからちょくせつ上澄みのDNAをPCR反応液にということもできなくはないですね。 まあうまく行くはせきにんもてません。

(無題) 削除/引用 No.1656-6 - 2013/04/19 (金) 00:43:13 - おお 簡略な方法は幾らかありますが 水酸化ナトリウムを使う方法とか 高い塩濃度をつかうとか、、、 でも3kとか難しいんじゃないかなぁ、、、 きっととか使えないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1656-5 - 2013/04/19 (金) 00:10:38 - ジムニー KYさん、ご親切にありがとうございます。 LATAQで3Kbのサイズを検出しようと思いましたが、難しいですかね…。 早速、明日試してみます！

(無題) 削除/引用 No.1656-4 - 2013/04/18 (木) 23:26:03 - KY 0.5% NP40と0.5% Tween20でlysis bufferを作って、 あとは普通にProK処理して、Boilして不活性かさせておけばよいと思います。 もちろん長いPCRは不向きです。

(無題) 削除/引用 No.1656-3 - 2013/04/18 (木) 23:13:42 - ジムニー SDSを入れたのはまずかったですね…。 サンプルを冷やしてSDSを析出させて遠心し、上清を1ulとってPCRしてもダメでした。 SDSが入ってないLysisバッファーは、どういった組成でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1656-2 - 2013/04/18 (木) 22:48:16 - KY 適当なlysisバッファー100ulに96wellの細胞を溶かして、プロK処理後、上精1ulをゲノムPCRに使用しておりました。 さすがにSDSを入れるのは、まずいと思います。

フェノールを使わずに細胞からPCRをしたい 削除/引用 No.1656-1 - 2013/04/18 (木) 20:18:52 - ジムニー 普段、接着細胞からSDSを含むプロK処理〜フェノール〜エタチン法を使ってゲノムを抽出してます。 このやり方でPCRはちゃんとかかるのですが、サンプル数が多いと正直煩わしいです。 そこで、フェノールを使わずに、もっと簡略的にPCRができるようなゲノムサンプルを調製できないでしょうか？ 試しにSDS＋プロKだけでゲノムを抽出してPCRをしてみましたが、バンドは何もでませんでした。

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