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(無題) 削除/引用 No.1647-5 - 2013/04/18 (木) 15:30:33 - DSC Pumpkin様 貴重な情報を頂き、感謝申し上げます。 primerの設計にそのようなTipsがあるのですね。 理屈では説明できない部分もありそうですね。 アニーリング温度やサイクル数についても検討しながら進めたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1647-4 - 2013/04/18 (木) 08:37:58 - Pumpkin AS-PCRをSYBRでやっています。 十分、よくワークしています。 酵素よりもPrimerの設計が重要です。 よくやれている方法として、 3'末端から2塩基目にSNP、3塩基目にミスマッチを 導入する方法です。 それでも、数コピーSNPとミスマッチを乗り越えた 増幅産物が出来てしまえば、それを鋳型として 増えてしまうので、アニーリング温度等をタイト にする系の最適化も必要です。 さらにそれでも、40cyclesも回せば、 後半には増えてきてしまうので、 見分けれれるサイクルの設定も必要です。 私はTOYOBOのThunderbird、もしくはKODのqPCR Mixを 使用しています。

(無題) 削除/引用 No.1647-3 - 2013/04/17 (水) 15:55:36 - DSC AP様 そうですね。Proofreading活性がない酵素でなければならないのはもちろんなのですが、PromegaのNative Taqでもミスマッチを乗り越えられてしまった経験があり、単にProofreading(-)でも向き不向きがあるのではないかと思っています。ニッポンジーンのGeneTaqは適しているというカタログ内の記述を見たのですが、手持ちがないため確かめたことはありません。どなたか経験に基づいた紹介をして頂けると有り難いのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.1647-2 - 2013/04/17 (水) 14:11:18 - AP 言うまでもないことですが、そういう用途では校正活性がない酵素、すなわちストレートなTaq polでなければいけませんね。そうなるとあんまり酵素の選択肢はないような。 校正活性があると、プライマーの3'末端のミスマッチを削ってしまうので、allele特異性がでません。

Allele-specific primerを用いたPCRに適した酵素は？ 削除/引用 No.1647-1 - 2013/04/17 (水) 13:36:39 - DSC 3’末をSNP部位に合わせて設計したプライマーを用いて2種類以上の遺伝子配列を個別・特異的にPCRで増幅させたいのですが、なかなか上手くいきません（一方のプライマーでの増幅産物をダイレクトシークエンシングすると、他方のプライマーで増幅されるべき配列も混在していることがわかる）。おすすめのPCR酵素をご存じの方がおられたら、教えていただけませんでしょうか？　また、このような対立遺伝子からの転写産物をqPCRで比較定量したいのですが、一般的なCybrGreenのプレミックスに含まれている酵素は、このような用途には不向きなのでしょうか？

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