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(無題) 削除/引用 No.1642-7 - 2013/04/16 (火) 20:40:49 - shRNAノックダウン MPさん、TSさん、KYさん　コメントありがとうございます。 これまた言葉足らずでしたが、ノックダウン実験ではプライマリー細胞と株化細胞を使っています。 プライマリ細胞では、シングルクローンではなくノックダウンした細胞のプール（言葉の使い方はあってますでしょうか？）を作成する予定です。 株化細胞も、今のところシングルクローンを取る予定はなく、ノックダウンした細胞プールを作成する予定です。 次回新しいshRNAベクターセットが届いたら、1ケずつのノックダウンと、4つまとめてノックダウン(25%量x4種)の両方をトライしてみようかと思っています。 もう一つの質問 Q2. 今回某社から買ったshRNAベクターは購入した4つともハズレのようでした。たいてい会社は「４つ（もしくは３つ）のshRNAベクターのうち、1つは75%以上のノックダウン効率が得られる」と謳っていますが、実際のところはどうなのでしょうか。 各会社で各ベクターごとのノックダウン効率を細胞を用いて評価はしてないと思いますので、当たるかどうかは運任せという感じなのでしょうか。特に、注文実績があまりないと思われるレアな遺伝子をターゲットとしている場合は。 につきましても、何かコメントがありましたら、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1642-6 - 2013/04/16 (火) 18:03:33 - TS あ、安定株を取るのですね。 確かにそれは容易ではない。。。現実的にはやるべきではなさそう。

(無題) 削除/引用 No.1642-5 - 2013/04/16 (火) 17:07:29 - KY Darmaconなどには複数のsiRNAを同時にトランスフェクションするものがあったりしますが、４つのベクターで安定発現株を作るのは難しいと思います。４つのベクターで薬剤耐性が別々ならともかく。

(無題) 削除/引用 No.1642-4 - 2013/04/16 (火) 16:46:36 - TS ありうるかと言われれば、ありうると思います。 DarmaconのsiRNAのラインナップの１つにSmart poolという４種類を混ぜたものもありますし。 でも一方で、MPさんがおっしゃられるようなことも懸念材料ですね。 試してみたらどうでしょう、と私は思いました。

(無題) 削除/引用 No.1642-3 - 2013/04/16 (火) 13:57:13 - MP ひとつの遺伝子に対して４つのshRNAを同時にというのはあまり良くない気がします。それだけoff-targetの確率が高まると思うので。私だったら1種類のshRNAのコピー数をあげるように努力します。もしコピー数が十分なのであれば、やっぱり配列が悪いんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1642-2 - 2013/04/16 (火) 12:08:41 - shRNAノックダウン 言葉足らずだったかもしれませんので、補足させてもらうと 1つのmRNAに対する配列の異なる4種のshRNAベクターを同時に感染させる、という意味です。 ノックダウン効率の評価はプライマリー細胞、株化細胞を用いて計3回行っています。 ノックダウン効率が非常に悪い、というのは実験手技の問題よりも、基本的にはベクター側の問題だろうと考えています。

4種のｓｈRNAウイルスベクターの同時感染 削除/引用 No.1642-1 - 2013/04/16 (火) 10:36:34 - shRNAノックダウン いつも勉強させてもらっています。 ウイルスを用いたshRNAによるノックダウン実験に取り組んでいます。 ノックダウン実験については経験がまだ浅いです。 shRNAベクターセット(4種＋コントロール）を某会社から購入し、ノックダウン実験を行いました。 実験の手順は割愛しますが、各ベクターをそれぞれ細胞に感染させ、首尾よくPuromycin耐性細胞を得ることができました。 ただ、残念なことにどのベクターでも十分なノックダウン効率が得られませんでした。WBでの評価でMax20%のreduction。 結果について販売会社に報告したところ、新たに別のコンストラクトのベクターセットを作ってもらうことになりました。これについては届き次第評価する予定です。 関連して、いくつか質問があります。 Q1. 4種のshRNAベクターを1つずつ別々のdishの細胞に感染させて、それぞれのベクターのノックダウン効率を評価したのですが、ラボでのミーティングで「4つ同時に感染させてみたらどうなの」という意見がありました。 　ノックダウン効率がいまひとつベクターを同時に感染させることでノックダウン効率が上がるということがあるのでしょうか？ 　もし同時感染させるとしたら、各ベクターのウイルス液をそれぞれ25%量で使うつもりです。 　そのコメントを聞いた後、他の文献など当たってみますといくつかのshRNAウイルスベクターを同時に感染させてノックダウン実験をしている文献もありました。基本的な点かもしれませんが、1ヶずつのベクターでノックダウンする方法とまとめていくつかを感染させてノックダウンする方法ではどちらか一般的なのでしょうか？使い分けのようなものがありますでしょうか？ 　 　 Q2. 今回某社から買ったshRNAベクターは購入した4つともハズレのようでした。たいてい会社は「４つ（もしくは３つ）のshRNAベクターのうち、1つは75%以上のノックダウン効率が得られる」と謳っていますが、実際のところはどうなのでしょうか。 各会社で各ベクターごとのノックダウン効率を細胞を用いて評価はしてないと思いますので、当たるかどうかは運任せという感じなのでしょうか。特に、注文実績があまりないと思われるレアな遺伝子をターゲットとしている場合は。 よろしくお願いします。

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