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XzCNjfGhPFIxzOoci 削除/引用 No.164-16 - 2017/10/22 (日) 04:52:29 - JimmiNi u6co05 http://www.FyLitCl7Pf7ojQdDUOLQOuaxTXbj5iNG.com

(無題) 削除/引用 No.164-15 - 2012/02/22 (水) 19:26:23 - カイ ＞TK-1様 いや、いずれは内在性のやつをそれらが働いていると思われる細胞種または組織からCo-IPすることが望まれるでしょうけどね。 293は所詮ターゲットの働いていると思われる細胞種ではないことが多いですし、ただの発現系ですが、とりあえずCo-IPを見ることがそのプロジェクトの出発点という場合も多いのでは？ そこでCo-IPを見れなかったら、それ以上続けるのは止めて別のプロジェクトを探す、とか。 何の意味もない、というわけではないと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.164-14 - 2012/02/22 (水) 09:21:27 - TK-1 10ｃｍdishでtransient transfection でしか見れないCo-IPに何の意味があるんだろうと思うのは私だけでしょうか？

御教示ありがとうございます。 削除/引用 No.164-13 - 2012/02/20 (月) 23:48:31 - たろうちゃん 　いろいろとアドバイスいただきましてありがとうございました。 　いろいろやりなおした結果やはり最初の系が小さすぎるのが原因の様です。10ｃｍdishでやり直してみてFlagのバンドは銀染でも見えるようになりました。 　ただ共沈降がポジコンと思われるものでもできていなかったので、RIPA bufferも変えてみようと思います。 　非常に勉強になりました。 本当に皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.164-12 - 2012/02/18 (土) 20:08:27 - 反リア充 まず細胞からのそのRIPA抽出液ウェスタンして、AとBがその中にあるかどうかみてみ。IPするなら可溶化されている事が前提だから。RIPAだって万能じゃないよ（RIPAの名前に惑わされたり、論文は上手く言ったデータしか出てないからRIPA=IP用みたくよく誤解してる人いるけど）。ないとこからいくらIPがんばってもそれはやっぱあれだろ。 RIPAでIPできることもあるけど、これは抗体と抗原とのアビディティしだいだから、なんでも上手く行くとは限らない。もちろんまったく駄目なものもいっぱいある。IPが一筋縄でいかない時は、Buffer組成変えたりや反応時間とか振って可溶化能と抗体反応という相反する要件を両方なんとか満たす妥協点を見つける努力はどうしても避けられない。ただタグがホールディング過程で変な感じに隠れたり、相互作用蛋白質の陰になってしまい、立体障害で抗体がうまいこと近づけないとかだと、ここでいくらがんばってもどうにもならないので、なんかそれっぽいかなというときは、一時撤収してタグの種類や位置の変更など作戦を立て直すことも急がば回れで案外得策かもしれない。

(無題) 削除/引用 No.164-11 - 2012/02/18 (土) 08:09:58 - モモ 一般的にはRIPAは免沈には使えても共沈には使えないです。

ご返信ありがとうございます。 削除/引用 No.164-10 - 2012/02/17 (金) 23:26:40 - たろうちゃん 　皆様非常に貴重なアドバイスありがとうございます。 非常に参考になりました。 　まず使用しているRIPA bufferはsanta cruzのRIPA lysis bufferというもので免疫沈降にも使えるとのことです。 やはりタンパク発現の系が小さいのですね。トランスフェクションはLipofectamineを使用しているので、もったいなくて小さい系でやってました。 次回は10cm dishでやるようにします。 　われわれの教室ではなかなか免疫沈降などの分子生物学的な方法を指導できる先生がいなくて、つい自己流でやって失敗を繰り返しております。 このサイトの皆さまからの忌憚のない意見は本当に参考になります。 ありがとうございます。

RIPAの組成は？ 削除/引用 No.164-9 - 2012/02/16 (木) 09:40:54 - mon カイさんの補足ですが、RIPAの組成はいろいろあって、SDSを使っている処方もあります。 お使いの組成がそうなら5~10倍に希釈するか、抽出効率が落ちるけどSDSがない組成に変更してみては。

(無題) 削除/引用 No.164-8 - 2012/02/16 (木) 09:25:39 - シリウス 私の実験例がご参考になれば幸いです。 （１）HEK293にFLAG融合タンパク質を安定発現。 （２）DynaBeads protein G 25 microL/sample使用。 （３）6-cm dish 1枚分の細胞 　　　 (免沈に使用するタンパク量は1000-1500 microg/25 microL beads) （４）anti-FLAG (1:100)でBeads処理 （即ち、Binding buffer 100 microLにanti-FLAG 1 microL） （５）IPは室温で1時間。 （６）RIPA使用。Sonication 10sec。 Dynabeadsの場合、発現タンパク質の量が少ないと、免沈物の検出が難しくなります。 恐らく、トピ主さんの場合、添加するタンパク質の絶対量が少ないのが、実験がうまくいかない大きな理由だと思います。

(無題) 削除/引用 No.164-7 - 2012/02/15 (水) 22:10:05 - カイ 一般的にはですけど、 RIPAとか超音波破砕ってキツ過ぎて免沈には不向きでは？ あと24wellの２well分っていくら強発現系でも少なすぎやしません？（2cm^2x2で4cm^2分ですよね…） モノによるでしょうけど293Tへの強発現系で共沈だと私なら6cm dish（20cm＾2)使って余裕もって回収する。リン酸カルシウム法だと安いし。リポフェクタミン等の高い試薬使う場合はちょっとためらうけど。 核タンパクということで抽出が難しくてRIPAとか超音波とか使ってるんでしたら、Triton0.1%~0.5%くらいで30分インキュベートにしてみたら？なんていう一般的に使うプロトコールを簡単にお勧めしても駄目かもしれないですけど。 私が以前使ってたタンパクも核にもいる（出入りする）タンパクで、Triton0.1~0.5%で共沈うまくいってましたけど、核タンパクでも特に中のほうにがっちりいるやつだと話はまた別かもしれない。 ラボで先輩等が使ってうまくいってる免沈の量とかバッファーとか超音波の有無とかはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.164-6 - 2012/02/15 (水) 22:00:44 - スケール　小さすぎ 一般論はあまり意味がないのですが、いくらなんでもそのスケールは小さすぎかと。 私なら、最低10ｃｍ１−２枚ですね。 あと最低限のコントロールが取れていない感じがします。 最初のライセート（もちろんオーバーナイトで抗体処理フラクションと同じように処理）、抗体非結合フラクション、すべてをある程度定量的に乗せてウエスタン。 この場合、結合率が5％くらいであると仮定して、定量的に電気泳動してウエスタン。そうでないと、ライセートを乗せすぎで、結合率が低い場合ほとんど何も分かりません。

(無題) 削除/引用 No.164-5 - 2012/02/15 (水) 21:22:55 - モモ O/Nで反応させてるということなので、目的の蛋白が分解している可能性はないですか？反応後の上澄みに目的蛋白が残っていることは確認できていますか？あるいは短時間で反応させて見るとか。 Flagの抗体は免沈できるものが多いですが、それらのうちのどれかを使っているのは確実なんですよね？ 抗体とビーズの組み合わせはOKですよね？ 今回は違うことですが、将来的にはRIPAで共沈というのはどうなんでしょう？条件がきついので、免沈ができたとしても共沈は難しい気がします。

返信有難うございます。 削除/引用 No.164-4 - 2012/02/15 (水) 21:19:56 - たろうちゃん 　早速の返信有難うございます。 　 使用している抗体は確かに免疫沈降にはしようできるとのことです。 　 　タンパク同士が相性が悪いのか、タグをつけて不安定になっているのかといった可能性は確かにあるかと思います。 　やはりまずcell lysateと免疫沈降後の上清、及び免疫沈降されたものでそれぞれFlag抗体でウェスタンしてどこに問題があるのか確かめてみるようにします。 　プロトコール的には問題ないでしょうか？ 　 　皆様はこういった実験の場合どのくらいの系で実験されていますでしょうか？24well plate 2well分のタンパク全量で普通免疫沈降はできるものなのでしょうか？もちろんトランスフェクション効率や細胞数、タンパクにもよるとは思いますが・・・・

(無題) 削除/引用 No.164-3 - 2012/02/15 (水) 21:08:47 - nana たろうちゃん様 おそらく、細胞内にてタンパク質が3次元的な立体構造をとった際、FlagやHisタグを巻き込んでしまい生理条件下では抗体と反応できなかったのではないでしょうか？ Hisタグの場合、Ureaなど変性条件下でNi担体を用いて精製すると素直にとれてくれることもあります。 上記の検討項目以外では、抗体が免疫沈降に使用できない場合もあります。 使用されている抗体の販売元に使用できる条件等の記載はありませんか？ なかった場合は、販売元に問い合わせてみるのもいいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.164-2 - 2012/02/15 (水) 18:45:30 - ~ �@ >タンパクAとBが発現しているのはcell lysateのウェスタンで確認 検出に用いたのはビーズに付けているのと同じ抗FLAG抗体と同じなのでしょうか？ そうであれば、FLAGがついていること自体は確認できていることになりますね。 （未変性では高次構造で抗体がアクセスできないという可能性は否定できませんが） 検出に目的タンパク質の本体に対する抗体を使っているのであれば、FLAGがついていない可能性も残りますよね。 �A Aのみ発現させた場合はどうなるのですか？ Bが抗体のアクセスを強固にブロックする可能性もありますよね。 �B ビーズと反応させる分の上清をWBしたら検出されるのですか？ >添加するタンパクの量が少なすぎるのでしょうか？ と書かれていますが、そもそも強制発現しているタンパク質量の情報がありません。 �C ビーズと一晩反応させた後の上清はWBしてみましたか？ 結合していなければ検出されるでしょうし、分解されていれば上清にもでてこないでしょう。

強制発現タンパクの免疫共沈降について 削除/引用 No.164-1 - 2012/02/15 (水) 17:40:35 - たろうちゃん 　いつも勉強させていただいております。 　この度、上記表題について教えていただきたいのですが、Flag tag付きタンパクAとHis tag付きタンパクBの結合について調べておりますが、免疫沈降自体がうまくいきません。 私のプロトコールに問題があるのでしょうか？初心者です。すいませんが、どなたかアドバイス頂けないでしょうか？よろしくお願い申し上げます。 ちなみにAもBも核内タンパクです。 　Flag tag付きタンパクAとHis tag付きタンパクBを発現するプラスミドを293 cellへトランスフェクションする。24well plate使用 　24well plateの2well分にRIPA lysis buffer with proteaseを100ulいれて、cell scryperでこすって、回収。 　氷の上で超音波処理してその上清を回収。 Dynabeads（磁石でビーズを分離するタイプ）で最初にFlag抗体3ug を付けて、次にタンパクAとBの入っていると思われる上清を加えて、4℃でovernight 翌日3回 washして、SDS sample buffer 30ulでboilして、ゲルへアプライ。 以上のようなプロトコールです。タンパクAとBが発現しているのはcell lysateのウェスタンで確認しております。免疫沈降したものをFlag抗体をあてても、全くバンドが出ず、銀染色してもIgGのみです。 添加するタンパクの量が少なすぎるのでしょうか？ どなたかアドバイスなど頂けないでしょうか？ よろしくお願いします。

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