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(無題) 削除/引用 No.1637-6 - 2013/04/16 (火) 05:52:31 - Atail 迅速なレスポンスに感謝致します。 > タンデムにshRNAを三つつなげたコンストラクトを作っているのをみたことがあります。 異なるsiRNAコンストラクトのpoolを使う場合もあると考えると、一つずつ発現させるより三つまとめて導入したほうが高いサイレンシング効果が得られるかも知れない訳ですね。make senseです。 > あと、40%では満足ではあなたの実験見たいもが変化しませんか? > KD実験はタンパクの半減期が長いと効果が見れるのに時間がかかるといわれています、もう少し培養を引っ張ってみるといいかもしれません。あるいは、とランジェンとでもけいだいしてもう一度トランスフェクションするとかもありかと。 なるほど。stableを取得した直後だと望む程クリアなサイレンシングが見られないケースもあるのですね。 > はじめのpuromycinによるセレクションによってどのくらいが生き残ったのでしょうか？普通のトランスフェクションによって安定発現株になるのは10%以下だと思います。３−４日後にも生き残っている細胞は単に一過性にpuromycin耐性遺伝子を発現した細胞で（ゲノムに組み込まれずに）、その後、新しいシャーレに移すことにはほとんどがpuromycin耐性遺伝子を脱落しているのではないでしょうか？ > 最後に死滅したときでも数パーセントぐらいは生き残っているような細胞はなかったのでしょうか？ > 私もまだセレクションが終わってないような印象があります。生き残っている細胞を培養し続け見てはどうでしょうか。 最初の選択で生き残った細胞数は10%以下だったので、それらしく思えました。ご指摘の通りpuro偽耐性だったのかと想像しますが、シャーレに移した後、一度プレートに接着しているにも関わらずpuro (-)の培地でも死んでしまったことが疑問です。puromycinはreversibleなはずですが、培地交換するだけでは阻害がリセットされないのでしょうか…。 当該遺伝子は293へのsiRNA導入でのKD例が論文になっていますが、60%ぐらいの阻害効果で、growth rateが低下することが報告されています。この遺伝子のKD が運悪くpuro耐性遺伝子の発現に影響…なんて可能性は有り得るのでしょうか。そもそもshRNAを発現させるという系自体をあまり見ない気がするのですが、遺伝子やコンストラクトによっては際立った効果が得られることもあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1637-5 - 2013/04/14 (日) 08:09:03 - おお タンデムにshRNAを三つつなげたコンストラクトを作っているのをみたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.1637-4 - 2013/04/14 (日) 06:58:55 - おお あと、40%では満足ではあなたの実験見たいもが変化しませんか? KD実験はタンパクの半減期が長いと効果が見れるのに時間がかかるといわれています、もう少し培養を引っ張ってみるといいかもしれません。あるいは、とランジェンとでもけいだいしてもう一度トランスフェクションするとかもありかと。 ベクターに SV40oriがはいっていれば293Tとかだともっと効率よくなる可能性はありますが、このベクターははいってないですよね。。。コンストラクト組みますか?

(無題) 削除/引用 No.1637-3 - 2013/04/14 (日) 06:45:28 - おお 私もまだセレクションが終わってないような印象があります。生き残っている細胞を培養し続け見てはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1637-2 - 2013/04/14 (日) 05:39:35 - KY > > その後puromycinで選択し、３〜４日後に耐性細胞を得ました。ところが、 > > １）293、Huh-7に関しては、耐性細胞を新たなシャーレに移したところ、12時間後にプレートへの接着が認められたものの、puromycinの有無にかかわらず24時間後にはほぼすべて死滅してしまいました。pLKOの空ベクターも同様の結果です。 はじめのpuromycinによるセレクションによってどのくらいが生き残ったのでしょうか？普通のトランスフェクションによって安定発現株になるのは10%以下だと思います。３−４日後にも生き残っている細胞は単に一過性にpuromycin耐性遺伝子を発現した細胞で（ゲノムに組み込まれずに）、その後、新しいシャーレに移すことにはほとんどがpuromycin耐性遺伝子を脱落しているのではないでしょうか？ 最後に死滅したときでも数パーセントぐらいは生き残っているような細胞はなかったのでしょうか？

shRNA安定発現株 削除/引用 No.1637-1 - 2013/04/14 (日) 04:35:48 - Atail pLKO1というベクターでノックダウン用の安定発現株を取ろうとしていますが、うまくいきません。 pLKOは293等に感染させてウイルス生産させるためのvectorですが、pLKOのみを単独でトランスフェクションさせてshRNA安定発現株を作るのにも使えるとのことで、試しております。しかし、pLKO、stable cellで検索するとウイルス生産用293の文献ばかりがヒットするので、こちらで情報が得られればと思いました。 はじめに293で一過性発現した際のKD効果を見たところ、40%程度の減少でした。一遺伝子につき３つの異なるshRNAコンストラクトを試していますが、似た様な変動でした。 その後puromycinで選択し、３〜４日後に耐性細胞を得ました。ところが、 １）293、Huh-7に関しては、耐性細胞を新たなシャーレに移したところ、12時間後にプレートへの接着が認められたものの、puromycinの有無にかかわらず24時間後にはほぼすべて死滅してしまいました。pLKOの空ベクターも同様の結果です。 ２）U2OSは、耐性細胞をpuro存在下で増やすことができましたが、ノックダウンの効果が全く見られませんでした。 ノックダウン実験が初めてなので、手順に不備があるのか、或いは方法そのものや細胞に問題があるのか、検討がつきません。考えられる問題点等があればご教授頂ければと思います。 発現は今のところウエスタンでのみ確認しておりますが、同じロットの細胞からmRNAを見るための準備もしております。

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