BioTechnicalフォーラム [トリプシンの効果]

トリプシンの効果

No.1634-TOPIC - 2013/04/13 (土) 20:07:09 - よう

お世話になっております。

トリプシンで細胞（ピューロマイシン耐性遺伝子もっている）をはがした直後に、ピューロマイシンを1µg/mLの濃度で入れると翌日、ほとんどの細胞が死んでしまいました。
先輩に聞いたら、細胞が接着してからピューロマイシンを入れなきゃダメだよと言われてしまいました。
細胞が浮いているとピューロマイシン耐性遺伝子はうまく発現できないのでしょうか？
もしくは、トリプシン自体にピューロマイシン耐性遺伝子を阻害する効果があるのでしょうか？
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全11件 ( 1 ～ 11 )　前 | 次　1/ 1. /1

(無題)

削除/引用

No.1634-11 - 2013/04/17 (水) 12:35:37 - おお

>[Re:8] ようさんは書きました :
> >[Re:7] おおさんは書きました :
> > >
> > >
> 細胞は接着せず死んでしまいました。細胞をまいて、翌日に感染した方が確実だとおもいます。
>
>
> 細胞が接着しない状態では、耐性遺伝子や他の遺伝子の発現が、接着した状態よりも鈍くなっているということでしょうか？

私の場合はセレクションしていないのに死んでいきましたから、ウイルスが感染する過程でディッシュへの接着阻害があるような気がします。なのでまいて、翌日に感染さらに必要なときはセレクションというのがいいとおもいます。感染とセレクション同時では感染から薬剤耐性マーカー発現のタイムラグのうちに死んだり調子よくなる細胞が出てきますので、感染とセレクションは時間をあけたほうがいいでしょう。たぶん他の方もそれは指摘しているようですけど。

(無題)

削除/引用

No.1634-10 - 2013/04/17 (水) 11:39:53 - ~

最初の書き込みだと、すでに薬剤耐性遺伝子を持っている細胞を撒いたように読み取れましたが、
>ピューロマイシン耐性遺伝子をベクターにもつウイルスを、導入したい目的の細胞にまいただけ
>つまり細胞のパッセージと同時にウイルスをふりかけました。
だと、まだ感染前または感染直後で、耐性遺伝子が発現していないのではないでしょうか。

ピューロマイシンはタンパク質合成阻害剤ですので、ピューロマイシン耐性遺伝子が発現する前に作用させてしまえば、感染しても耐性遺伝子が発現できませんよね。

(無題)

削除/引用

No.1634-9 - 2013/04/17 (水) 11:34:21 - mon

ウイルス感染後、楽剤耐性遺伝子の発現レベルが安定（増加）するまで、1-2日ほど置いたほうが良いです。特にピューロマイシンの効きは素早く出てくるので。
1st day ウイルス感染
3rd day薬剤添加
4th~ day ピューロマイシンなら遺伝子導入されていない細胞が死に始める。
経験上おおよその目安として、ピューロマイシンなら6-7th day, ブラストサイジンなら、7-8th day, ハイグロマイシンなら、8-11th day, G418なら 10th~18th dayで生き残っている細胞なら、遺伝子導入されていると判定しています。
必ず濃度・判定時間等を使っている細胞で検討してください。

(無題)

削除/引用

No.1634-8 - 2013/04/17 (水) 11:17:28 - よう

>[Re:7] おおさんは書きました :
> >
> >
細胞は接着せず死んでしまいました。細胞をまいて、翌日に感染した方が確実だとおもいます。

細胞が接着しない状態では、耐性遺伝子や他の遺伝子の発現が、接着した状態よりも鈍くなっているということでしょうか？

(無題)

削除/引用

No.1634-7 - 2013/04/17 (水) 04:52:27 - おお

>[Re:6] ようさんは書きました :
>
> > 耐性遺伝子が入っているとかかれていますが、具体的にどの様なじょうたいなのでしょうか。
> >
> > 完全に耐性を獲得した安定発現株であれば、あなたのやり方は間違えではありません。
>
> ピューロマイシン耐性遺伝子をベクターにもつウイルスを、導入したい目的の細胞にまいただけの状態です。まいた時点で細胞はまだ浮いた状態です。つまり細胞のパッセージと同時にウイルスをふりかけました。

接着した細胞で感染してから処理(実験、セレクションではないです)する時間をかせごうとレンチでまきこむとき(けいだいのとき)にウイルスの入ったバイチを使ったことがあります。細胞は接着せず死んでしまいました。細胞をまいて、翌日に感染した方が確実だとおもいます。

細胞によってはうまく行くものもあるかもしれませんが、、、

セレクションは感染ご１日ぐらいずらした方がいいとおもいます。

(無題)

削除/引用

No.1634-6 - 2013/04/16 (火) 17:30:58 - よう

> 耐性遺伝子が入っているとかかれていますが、具体的にどの様なじょうたいなのでしょうか。
>
> 完全に耐性を獲得した安定発現株であれば、あなたのやり方は間違えではありません。

ピューロマイシン耐性遺伝子をベクターにもつウイルスを、導入したい目的の細胞にまいただけの状態です。まいた時点で細胞はまだ浮いた状態です。つまり細胞のパッセージと同時にウイルスをふりかけました。

(無題)

削除/引用

No.1634-5 - 2013/04/14 (日) 22:40:13 - JJI

接着してから選択培地に変えてみてどうなるかやって見るのがいいと思います。

(無題)

削除/引用

No.1634-4 - 2013/04/14 (日) 11:39:16 - AP

接着していると浮遊している状態より培地に接する表面積が小さくなるし、上皮系なんかだと細胞間の接着（タイトジャンクション）なんかもできてきて薬剤の浸透なんかも制限されるので、至適濃度が異なるということはあるかもしれません。

(無題)

削除/引用

No.1634-3 - 2013/04/14 (日) 00:21:08 - おお

耐性遺伝子が入っているとかかれていますが、具体的にどの様なじょうたいなのでしょうか。

完全に耐性を獲得した安定発現株であれば、あなたのやり方は間違えではありません。