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(無題) 削除/引用 No.1632-14 - 2013/04/13 (土) 12:35:36 - おお そうそう、セレクションしてなくても起こります。トランスフェクションがあまりうまくいってなくって(かなり効率がわるかったり)、試薬などの毒性ができたときとかもみれます。そういう経験があるので単に高発現で死んだと結論するにはちょっと違和感があります。 apoptotic bodiesは細胞の内容物が高密度にパックされているともいわれてますので、蛋白のデンシティーが上がったため強く光るのかもしれません。その場合は発現量は見た目ほど高くないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1632-13 - 2013/04/13 (土) 07:26:16 - 普通 あの、、、固定しても光りますから、分子機構としては分解されていなければよいようです。ちょっと検索すると分かります。 固定（完全死）してたほうが、発光が安定するというのが普通と私は思っています。（専門家にそういわれた）。過剰発現して死んでも、分解されなければ、、、ということかと。 私の経験としては死んでるかどうかは知りませんけど、そういったことは普通です。

(無題) 削除/引用 No.1632-12 - 2013/04/12 (金) 21:36:32 - かきのき 　GFPを発現した後になんらかの原因で細胞が死んでいると思います。GFPの種類にもよりますが、大量に発現したGFPそのものあるいはその分解物が細胞毒性を持ち、細胞死に働くケースがあります。 　RNAの抽出は可能でしょうが、RNAse活性が上がっている可能性も高いと思うので、特に定量解析には注意が必要でしょう。

(無題) 削除/引用 No.1632-11 - 2013/04/12 (金) 17:16:55 - ~ >死んだ細胞からのRNAって評価できますか? 仮説が、発現量が高すぎて死ぬ、ですのでタイムコース次第では高発現の時があることになるかと。 特殊な細胞やプロモーターを使っているか、実験系の組み立て方の練習をさせたいのでない限り、ボスがやらせることはないでしょうから、思考実験と思っています。

(無題) 削除/引用 No.1632-10 - 2013/04/12 (金) 16:18:33 - おお 死んだ細胞からのRNAって評価できますか?

(無題) 削除/引用 No.1632-9 - 2013/04/12 (金) 15:16:05 - ~ >何を基準に発現量が多い、少ないと判断すればよいのでしょうか？ GFPの発現量が多いから細胞が死んだという仮説なのですよね。 そうであれば、生き残っているGFP発現細胞は、発現量が低いために死ななかったということになり、比較対象の一つになりうるでしょう。 >定量的PCRで発現量チェックが考えられると思いますが PCRをするのであれば、どこからPCRのテンプレートを回収するかを考えておきましょう。 今は死んでいる細胞と生きている細胞が混ざった状態でしょうから、それぞれを分けてRNAを回収しないと、両者の比較はできませんよね。

(無題) 削除/引用 No.1632-8 - 2013/04/12 (金) 13:18:05 - おお GFPの蛍光を見てるんだから発現量を反映しているんではないでしょうか。 一体何をどの様に比べたいのか不明ですけど。

(無題) 削除/引用 No.1632-7 - 2013/04/12 (金) 13:08:30 - よう 遺伝子を導入していない細胞では見られないので、自家蛍光ではないと思います。定量的PCRで発現量チェックが考えられると思いますが、この場合、何を基準に発現量が多い、少ないと判断すればよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1632-6 - 2013/04/12 (金) 12:14:07 - ~ >GFPの発現量が多すぎて、死んだあとでも光っているという可能性はないのでしょうか？ 可能性はあります。 自家蛍光ならば、#2の2行目に書かれた方法で確認できますね。 発現量が多すぎる場合にどのような方法で確認できるか考えてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1632-5 - 2013/04/12 (金) 12:03:23 - おお んRFPで光っている死んだ細胞は緑には光らないんだよなぁ。。。感度をあげると自家蛍光も見れるのかもしれませんが、それ以上のシグナルのようなきがしてきました。

(無題) 削除/引用 No.1632-4 - 2013/04/12 (金) 12:00:54 - おお 原因はなんにせよ、死んだ細胞がGFPのシグナルかどうかおいておいて、蛍光が検出されることはよく経験します。 RFPでも同じようなことがあるので(ちょっと記憶があいまいですが)自家蛍光なのかはよくわかりません。

(無題) 削除/引用 No.1632-3 - 2013/04/12 (金) 11:56:22 - よう この場合、GFPが入った細胞でも、ピューロマイシン濃度が濃すぎて、死んでしまうのですが、GFPの発現量が多すぎて、死んだあとでも光っているという可能性はないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1632-2 - 2013/04/12 (金) 11:51:39 - ~ 死細胞の自家蛍光を見ているのでは？ 遺伝子を導入していない細胞またはヌルベクターを導入した細胞をピューロマイシン処理した場合でも見られませんか？ http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cyto.990140815/pdf あたりが参考になるかもしれません。

死細胞もGFPで光るか 削除/引用 No.1632-1 - 2013/04/12 (金) 11:12:22 - よう いつもお世話になっています。 ある細胞にGFPを入れて、ピューロマイシンでセレクションしたのち、顕微鏡観察をすると、死んでると思われる細胞でもGFPで光っているように見えます。こういったことは起こりうることなのでしょうか？だとしたら、どういう原理で光っているのですか？

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