Bio Technical フォーラム

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発現していない確認 トピック削除
No.1623-TOPIC - 2013/04/10 (水) 05:50:29 - え
ゲノムデータベースのある遺伝子のqRT-PCRを培養細胞と組織でしていますが、増幅シグナルが得られたことがありません。プライマーを変えてもだめで、パブリックのマイクロアレイのデータをみてもシグナルは無いような感じです。マイナーな遺伝子で抗体もありません。
調べた細胞で発現していない（か検出できないくらい低い）と言いたいのですが、ポジコンはcDNAを使うのでしょうか。一応ESTがあるのですが。。。
　
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No.1623-7 - 2013/04/11 (木) 09:57:56 - AP
思いついたままに、

・言わずもがなですが、ポジティブコントロールで検出限界を示そうという場合、実験区のサンプルと同様の系にポジコン用の鋳型を混ぜてやるべきでしょうね。。ポジコンのみでやるのと夾雑物が存在する場合とでは挙動が違いますから。また、微量のポジコンのみだと、吸着ロスによりリニアリティが失われるでしょう。


・もし、サンプルからゲノム由来の増幅も見られないなら、コントロールとしてゲノム由来のPCR産物（ただし、増幅効率を著しく下げるような長いイントロンを含まないか、シングルエクソンのみに由来する）にしてもいいのでは。あるいは、人工的にちょっと長さを変えてやるとか、ユニークな制限酵素サイトをいれるとかして、何由来の産物かを区別できるようにするとか。この場合、real-time PCRではなくて、電気泳動で観るわけですが。


・RT-PCRでは、逆転写効率のブレが大きく影響します。ポジコンも理想的にはin vitro transcriptionで作ったRNAがいいと思います。DNAのポジコンで検出できるけれどRT-PCRでは見えないのは、実際にはRNAはあるのだけれども逆転写効率の低さで検出限界以下になっているのではないかという点がクリアにできます。

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No.1623-6 - 2013/04/11 (木) 01:24:24 - え
コメント感謝します。bone, ovary, mammary glandなどのライブラリーでESTがあるのですが、そのクローンを買ってインサートを確認して・・・は手間なので、PCRで増やす領域のオリゴDNAを合成してそれをテンプレートにしようかと思い始めてます。

「発現していなかった」とデータを出さず一行加えることになるとおもうのですが、cDNA（オリゴDNA)からは増えることだけ確認しておこうと思ってます。

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No.1623-5 - 2013/04/11 (木) 00:44:53 - おお
mRNAがないなら抗体を使わなくとも、発現にかんしてはRNAレベルで話ができると思います。結局抗体でも抗体だけで示すとしたなら検出限界いかはいえても、発現してないという結論にならないかもしれないのは同様ですし。

やはりすでに回答がありますように、これなら発現してない、していても意味がないとおもえるようなthresholdをきめて(decideして)それ以下であるというのがいいとおもいます。あとはテクニカルな検出限界以下という場合もあるかも思いますが。

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No.1623-4 - 2013/04/10 (水) 20:13:49 - ぼずすかっぐ
ESTの組織はなんですか？

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No.1623-3 - 2013/04/10 (水) 06:23:03 - KY
そのcDNAをポジコンにして１コピー（せめて１０コピー）からでもqRT-PCRで検出できるが、培養細胞や組織からのサンプルでは検出できないとなれば、発現してない、もしくは検出限界だと言えると思います。

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No.1623-2 - 2013/04/10 (水) 05:52:25 - え
GAPDHとかほかの遺伝子は増えてます、念のため。

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No.1623-1 - 2013/04/10 (水) 05:50:29 - え
ゲノムデータベースのある遺伝子のqRT-PCRを培養細胞と組織でしていますが、増幅シグナルが得られたことがありません。プライマーを変えてもだめで、パブリックのマイクロアレイのデータをみてもシグナルは無いような感じです。マイナーな遺伝子で抗体もありません。
調べた細胞で発現していない（か検出できないくらい低い）と言いたいのですが、ポジコンはcDNAを使うのでしょうか。一応ESTがあるのですが。。。
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