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(無題) 削除/引用 No.1607-6 - 2013/04/08 (月) 19:13:48 - qq E7.5はまだ手足も頭もできていないというか、大変小さなただの袋ですよね。全細胞数も大変少ないので、そこからどうしても目的の細胞群を取り出したいのであれば、それなりの方法を考えなくてはいけないでしょうね。 以下はマウス胎児のデータベースです。E7.5dの遺伝子発現などもサーチできるようです。 www.emouseatlas.org/emap/home.html

(無題) 削除/引用 No.1607-5 - 2013/04/08 (月) 17:42:10 - ~ MEFの回収しかしたことがなく、細胞数は気にしたことがありません。 http://dev.biologists.org/content/42/1/293.full.pdf+html によれば、1embryo体あたり1.5 x 10^4位の細胞がいるようですね。 回収率の相場が分かりませんが。 >洗浄作業（各ステップ3回洗浄）で細胞数がどんどん減っているような印象があります そう考えているのであれば、まずは予備検討として洗浄作業を前後の細胞数を数えてはいかがでしょうか。 スタート地点で少ないのか、ロスが多いのかでは、取れる対象法が変わってきます。 >ピペッティングにて単細胞に解離 後にきちんと細胞が単細胞にかい離しているかは見ていますか？ ここは重要なポイントの一つのはずです。 >A陽性B陽性細胞と、A陽性B陰性細胞を回収したい ということであれば、極端な話、Aだけでもネガティブな細胞株で細胞数を水増しすればソーターにはかけて目的の陽性細胞が得られますよね。 さすがに細胞を入れるのは気持ち悪いでしょうけれども、無蛍光のビーズであればコンタミしても増殖や代謝がないので影響は少ないでしょう。 >A陽性B陽性細胞は全体の3%程度、A陽性B陰性細胞は全体の1%程度のようです。 >10個体で2x10^4個程度しか >100匹ほどのembryoを回収する必要 全部まとめると、ソーターにかけたい（かけられる最小限の）細胞数は2x10^5で、そこから A陽性B陽性細胞：6000個 A陽性B陰性細胞：2000個 を回収しようとしているのですよね。 この細胞数で次の分化実験には足りるのでしょうか？ 回収率を増やして2x10^5個の細胞を用意できたとしても、必要な細胞数が回収できないのであれば、embryoの数を増やす必要があるでしょう。 ところで、マウスでは小さすぎて実験できない場合に、代わりにラットを使うことはよく見かけますが、今回は動物の変更が難しい系なのでしょうか？ E7.5でマウスとラットに細胞数の違いがあるのか知りませんが。

(無題) 削除/引用 No.1607-4 - 2013/04/08 (月) 15:33:23 - embryo qq様 ご返信ありがとうございます。 素人質問ではない、ということですが、胎児を扱う研究はこれまで行ったことがありませんでした。ですので、本分野の素人研究者でございます。 現在の予定では、2つの細胞集団をFACSにて単離したいと考えております。全細胞は抗原Aと抗原Bによって4つの細胞集団にわかれるのですが、そのうち、A陽性B陽性細胞と、A陽性B陰性細胞を回収したいと思っています。抗原Bに関しては胎児期での発現がほとんど解析されていないため、現在研究を進めております。 さて、ご質問の件ですが、 > １）ホールマウントで抗体染色はできるのでしょうか？ > ３）あなたの探したい抗体反応性細胞は、ホールマウントで考えて、いくつあるのでしょう？ ホールマウントの抗体染色、行ったことはございません。これから手技を勉強する予定でございます。まずは抗原Bの発現をホールマウントで確認し、その後抗原Aと双方で染色できれば、、と考えていますが、そこまでのデータが必要かどうか、考え中です。 ちなみにFACSでの割合を見る限りでは、A陽性B陽性細胞は全体の3%程度、A陽性B陰性細胞は全体の1%程度のようです。 > ２）いったい、E7.5は、何セルていどの細胞数なのでしょうか？ すみません。質問の意味が良く分からないのですが、回収できる総細胞のことでしょうか？E7.5 1個体でどの程度の細胞数か把握できておりません。 > ４）細胞の分散からファックス検出まで、収率を下げるところはあるのでしょうか？ 抗原Aと抗原Bを同時に染めようとすると、3回抗体反応を行う必要があり、それに伴う洗浄作業（各ステップ3回洗浄）で細胞数がどんどん減っているような印象があります。現在、洗浄回数を減らしてみようと思っています。（といっても3回を2回にするだけですが） E7.5から目的の細胞が単離できた場合、それら細胞の分化能を評価するという研究を予定しています。あまり少ない細胞数では、分化実験をスタートできないので、多くの細胞が必要となる、と感じています。 ~様 ご返信ありがとうございます。 セルソーターにかける細胞数が少ないということでございます。 これまで胎児を扱ったことがなかったので、総細胞数がどの程度かというのは考えてみたこともなかったのですが、実際に自分でやってみますと、予想以上に細胞が少なかったので、困ったしまったというのが現状でございます。 例えば、E7.5胎児10個体程度を回収すると、総細胞数としてどの程度得られるのか、ご助言頂きたく、今回質問させていただきました。 現状では10個体で2x10^4個程度しか総細胞で回収できておりません。 ですので、もし、10個体から1x10^5個ぐらい得られるのでしたら、私の回収法が悪いということになりますし、2x10^4個ということでしたら、これが当然の結果、ということになります。 参考までに、E7.5胎児を回収後、単細胞にする方法を記載します。 ①PBS中に胎児を移動し、遠心。 ②cell dissociation bufferにて反応　37℃ 30min ③ピペッティングにて単細胞に解離し、FACS buffer (PBS/5%FBS)を加える。 ④遠心 ⑤抗体反応開始

(無題) 削除/引用 No.1607-3 - 2013/04/05 (金) 17:12:39 - ~ >セルソーターで単離するだけの細胞数を確保することができませんでした。 文字通りに受け取ると、目的の細胞の回収数が足りないという話ではなく、 セルソーターにかけるための（総）細胞数が足りないということでしょうか？ 目的の細胞自体は含まれているのでしたら、コントロール用のビーズを足して必要なパーティクル数にしてはいかがでしょうか。 目的の細胞は蛍光で拾えるのですよね。

(無題) 削除/引用 No.1607-2 - 2013/04/05 (金) 12:55:56 - qq 素人がする質問ではありません。 ところで、素人の質問レスに答えていただけますか？ E7.5dって、神経管ができたところ程度（？）なのでしょうが、あなたは、 １）ホールマウントで抗体染色はできるのでしょうか？ ２）いったい、E7.5は、何セルていどの細胞数なのでしょうか？ ３）あなたの探したい抗体反応性細胞は、ホールマウントで考えて、いくつあるのでしょう？ ４）細胞の分散からファックス検出まで、収率を下げるところはあるのでしょうか？

E7.5-E8.0 embryo由来細胞の単離について 削除/引用 No.1607-1 - 2013/04/04 (木) 19:31:03 - embryo 皆様 現在、C57BL/6妊娠マウスからE7.5-E8.0のembyoを回収して、ある特定の細胞分画をセルソーターにて単離しようと思っています。 先日、E7.5のembryo 10匹分を回収しましたが、セルソーターで単離するだけの細胞数を確保することができませんでした。 そこで質問なのですが、E7.5-E8.0ぐらいのembryoを用いた場合、何個体ぐらいのembryoを扱うのが普通なのでしょうか？？ もちろん、単離したい細胞画分の割合によるとは思うのですが、 現在の私の条件では100匹ほどのembryoを回収する必要になってしまいます。 そうなると、妊娠マウスも同時に10-15匹ほど必要になりますし、embryoを回収するだけで数時間要しますので、現実的ではないように思ってしまいます。 それとも、このような実験を行う場合は、力技なのでしょうか・・？ 素人質問ですみません。 どなたか、ご返信よろしくお願いいたします。

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