qq様
ご返信ありがとうございます。
素人質問ではない、ということですが、胎児を扱う研究はこれまで行ったことがありませんでした。ですので、本分野の素人研究者でございます。
現在の予定では、2つの細胞集団をFACSにて単離したいと考えております。全細胞は抗原Aと抗原Bによって4つの細胞集団にわかれるのですが、そのうち、A陽性B陽性細胞と、A陽性B陰性細胞を回収したいと思っています。抗原Bに関しては胎児期での発現がほとんど解析されていないため、現在研究を進めております。
さて、ご質問の件ですが、
> １）ホールマウントで抗体染色はできるのでしょうか？
> ３）あなたの探したい抗体反応性細胞は、ホールマウントで考えて、いくつあるのでしょう？
ホールマウントの抗体染色、行ったことはございません。これから手技を勉強する予定でございます。まずは抗原Bの発現をホールマウントで確認し、その後抗原Aと双方で染色できれば、、と考えていますが、そこまでのデータが必要かどうか、考え中です。
ちなみにFACSでの割合を見る限りでは、A陽性B陽性細胞は全体の3%程度、A陽性B陰性細胞は全体の1%程度のようです。
> ２）いったい、E7.5は、何セルていどの細胞数なのでしょうか？
すみません。質問の意味が良く分からないのですが、回収できる総細胞のことでしょうか？E7.5 1個体でどの程度の細胞数か把握できておりません。
> ４）細胞の分散からファックス検出まで、収率を下げるところはあるのでしょうか？
抗原Aと抗原Bを同時に染めようとすると、3回抗体反応を行う必要があり、それに伴う洗浄作業（各ステップ3回洗浄）で細胞数がどんどん減っているような印象があります。現在、洗浄回数を減らしてみようと思っています。（といっても3回を2回にするだけですが）
E7.5から目的の細胞が単離できた場合、それら細胞の分化能を評価するという研究を予定しています。あまり少ない細胞数では、分化実験をスタートできないので、多くの細胞が必要となる、と感じています。
~様
ご返信ありがとうございます。
セルソーターにかける細胞数が少ないということでございます。
これまで胎児を扱ったことがなかったので、総細胞数がどの程度かというのは考えてみたこともなかったのですが、実際に自分でやってみますと、予想以上に細胞が少なかったので、困ったしまったというのが現状でございます。
例えば、E7.5胎児10個体程度を回収すると、総細胞数としてどの程度得られるのか、ご助言頂きたく、今回質問させていただきました。
現状では10個体で2x10^4個程度しか総細胞で回収できておりません。
ですので、もし、10個体から1x10^5個ぐらい得られるのでしたら、私の回収法が悪いということになりますし、2x10^4個ということでしたら、これが当然の結果、ということになります。
参考までに、E7.5胎児を回収後、単細胞にする方法を記載します。
@PBS中に胎児を移動し、遠心。
Acell dissociation bufferにて反応 37℃ 30min
Bピペッティングにて単細胞に解離し、FACS buffer (PBS/5%FBS)を加える。
C遠心
D抗体反応開始 |
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