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(無題) 削除/引用 No.1534-6 - 2013/03/12 (火) 09:42:09 - IP初心者 おおさん、ありがとうございます。 inhibitor含めLysis bufferと同じ組成のものをwashにも使ってみます。 TritonXの濃度は適宜調節してみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1534-5 - 2013/03/12 (火) 03:16:26 - おお >[Re:4] IP初心者さんは書きました : > 補足です。 > やっている実験はco-IPです。 > > 過去の掲示板で、EDTAがタンパク間結合を解離させることがあるというような記載を見ました。 > > そういう点でEDTAをwash bufferから抜いたほうがいいものかどうか考えています。 > > EDTAあり、なしの両方の条件で試せば済む話ではありますが。 金属イオンが結合に関与していれば、EDTAで結合が弱くなったりはずれる可能性はあります。その場合はwashにくわえて、lysis buffer にも入れない方が賢明だとおもいますが、、、 グリセロールは場合によってはコンプレックスを安定させることがあるようです。入れておいてもいいんじゃないかなぁとはおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1534-4 - 2013/03/11 (月) 21:38:18 - IP初心者 補足です。 やっている実験はco-IPです。 過去の掲示板で、EDTAがタンパク間結合を解離させることがあるというような記載を見ました。 そういう点でEDTAをwash bufferから抜いたほうがいいものかどうか考えています。 EDTAあり、なしの両方の条件で試せば済む話ではありますが。

(無題) 削除/引用 No.1534-3 - 2013/03/11 (月) 21:00:05 - IP初心者 おおさん、ありがとうございます。 IP後は、SDS-PAGE, WBを予定しています。 Protease inhibitor, Phosphatase inhibitor cocktailはwashの際にも、基本的には入れるようにします。 もう一点確認ですが、EDTAやGlycerolもLysis bufferと同様wash bufferにも入れたほうがいいでしょうか。 過去の掲示板で「EDTAは抜いたほうがいい場合もある」との記載を見つけて気になっています。 Lysis bufferは先のメールに書いたものに10%Glycerolが入っています。(※Glycerolのことを書き忘れてました) 　50 mM Tris-HCl pH7.5 　150 mM NaCl　 　5 mM EDTA 　1% TritonX-100 　10%Glycerol 　protease inhibitor cocktail（Sigma) 　Phosphatase inhibitor cocktail (Sigma) よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1534-2 - 2013/03/11 (月) 14:46:45 - おお 基本的に入れとけばいいかとおもいます。 SDS PAGEやWBでなく、IPフラクションを用いて反応させるような場合は最後のあらいで邪魔なものを除くといいかもしれません。ただしイリバーシブルな阻害剤は抜いてもリカバーしませんのでよく実験をねってからやったほうがいいですね。

IP時のwash bufferにはprotease inhibitorをいれる？ 削除/引用 No.1534-1 - 2013/03/11 (月) 13:20:06 - IP初心者 よろしくお願いします。 最近、免疫沈降に取り組み始めたものです。 IPに関しては上司も十分な経験がなく、論文やネットの情報・プロトコールを参考に試行錯誤しているところです。 wash bufferに関して質問があります。 wash bufferにもProtease inhibitorやPhosphatase inhibitorを加えたほうがいいのでしょうか？ 培養細胞からタンパクを回収する際は、下記の組成のLysis bufferを用いています。 Lysis buffer 　50 mM Tris-HCl pH7.5 　150 mM NaCl　 　5 mM EDTA 　1% TritonX-100 　protease inhibitor cocktail（Sigma) 　Phosphatase inhibitor cocktail (Sigma) 論文などをみると、「washの際にもLysis bufferを用いた」とよく記載されていますが、そのLysis bufferはinhibitor込のLysis bufferということなのでしょうか、それともinhibitor抜きのLysis bufferということなのでしょうか。 基本的なところですみませんが、よろしくお願いします。

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