全30件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

FastCloningで一度に連結可能な断片数 削除/引用 No.1520-30 - 2017/08/17 (木) 13:04:58 - ゲン カメレスですみません。 ＞１）FastCloningの論文では、複数断片の実施例が載っていませんが、経験上、何＞断片のクローニングが可能でしたでしょうか？ 一度、試したのですが、うまく行かなかったので、その後は、１つずつ入れています。ただ、１つ目の断片がうまく入ったのをコロニーPCRで確認する際に、うまく入っていたならば、増幅断片をそのまま、第２の断片連結に使っています。 ＞２）経験上、最も短い断片長はどれくらいでしたでしょうか？ 700bpは入りました（EGFPとｍCherryの交換）。確かに、短いと入りにくいのかなとは感じました。

FastCloningで一度に連結可能な断片数 削除/引用 No.1520-29 - 2017/06/27 (火) 16:14:51 - matsu 最近になって合成遺伝子を利用しだして、このトピックにやってきました。 １）FastCloningの論文では、複数断片の実施例が載っていませんが、経験上、何断片のクローニングが可能でしたでしょうか？ ２）経験上、最も短い断片長はどれくらいでしたでしょうか？ SLICE法の論文から大腸菌の培養をLate phase まで行ってエレクトロコンピテント細胞を調整したほうがよいのかとも思いましたが、FastCloning以後の類似の論文をみても案外その必要もないようですね。

FastCloning 削除/引用 No.1520-28 - 2016/09/03 (土) 20:06:14 - ゲン >Shinさん 安上がりで手間いらずなので、FastCloningばかりを使っています。 いつも使っている大腸菌（DH10B）や酵素（iProof）でも 上手く行っています。DH5αでも上手くいくと聞いています。 サイクル数は通常の30回でやっています。 コンピテントセルは、DH10Bを培養して自前で作っており、 効率はそう良くないはずですが、コロニーは 結構出てくるので、コンストラクト作りは順調に進んでいます。 制限酵素とリガーゼを使っていたあの苦労は なんだったんだろう？という感じです。 FastCloningの相同組換えの原理は、 下記サイトに書いてある連結の原理と同じなのではないかと思えます。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100005179

FastCloning 削除/引用 No.1520-27 - 2016/04/06 (水) 21:47:05 - Shin ＞ゲンさん この投稿にレスついてたんですね…。最近は、in-fusionのcloning enhancerが便利なんで、そっちに回帰しつつあったのですが、どうもオバーラップ部位で一塩基欠けたり、2フラグメント以上同時にクローニングするときなど、トラフォメ後のシングルコロニーが単一クローンでない（その後シングルコロニーアイソレーションすればよいのですが…）ことが多く、またこのスレを勉強しなおしていたところです。 ＞PCR後に、少量を電気泳動して、DNA濃度を見積もって、等モル比になるように混ぜてます。 たまに低いサイクル数でも、反応が良すぎて増えすぎた場合には、後でモル比で調整してもうまくいかないことがあったような気がしますが、どうでしょうか。あと、サイクル数が低すぎてほとんど増えてないと、やはりサイクル数上げてやり直しとなることが多かった気がします。コンピの性能が良ければいいのかな…？

PPY株以外の大腸菌を用いたSLiCE 削除/引用 No.1520-26 - 2015/11/28 (土) 21:53:05 - はまじ 一般的な菌株（JM109、DH5a）などからのライゼートを用いてSLiCEが出来るという報告がありました。論文はこちらです。 http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/47 ReｃA＋の菌株でも問題ないとのことでした。

FastCloning 削除/引用 No.1520-25 - 2014/08/11 (月) 19:02:06 - ゲン PCR後に、少量を電気泳動して、DNA濃度を見積もって、等モル比になるように混ぜてます。どうしてこんなに簡単につながるのかその理屈がいまいち分かりませんが、うまくつながっているようです。

FastCloning 削除/引用 No.1520-24 - 2014/05/19 (月) 14:04:27 - Shin こういうのもあります。ただ、PCRのサイクル数を調節して、インサートとベクター比を揃えなければならないのがめんどくさいです。使用してみて何か良い解決策を思いついたら教えて下さい。 FastCloning: a highly simplified, purification-free, sequence- and ligation-independent PCR cloning method Li et al. BMC Biotechnology 2011, 11:92 http://www.biomedcentral.com/1472-6750/11/92

(無題) 削除/引用 No.1520-23 - 2013/05/24 (金) 11:14:09 - Terminator 5 形質転換するしGibson assemblyにligase必要なさそうじゃないですか？ それならPCR後にT5 exonuclease加えるだけでよいのかな。

ギブソン法 削除/引用 No.1520-22 - 2013/05/23 (木) 13:16:47 - Jujo 私も実際に行ったことがないのですが、反応温度も重複配列の設計も原理は他2法と同じように思います。 ダイレクトシークエンスというより短い断片をつなぐ方に使われる目的で作られたようですね。 http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%AE%E3%83%96%E3%82%BD%E3%83%B3%E3%83%BB%E3%82%A2%E3%82%BB%E3%83%B3%E3%83%96%E3%83%AA http://www.synbio.org.uk/dna-assembly/guidetogibsonassembly.html

(無題) 削除/引用 No.1520-21 - 2013/05/23 (木) 12:13:13 - びん Jujo様 情報をありがとうございます。 ランニングコストも高く無さそうですね。 ちらっと見ただけなのですが、どこが、In fusionクローニングとかGeneArtと違うのでしょうか？

ギブソンアッセンブリー 削除/引用 No.1520-20 - 2013/05/22 (水) 11:00:30 - Jujo http://www.nebj.jp/products/detail/1238 こういう技術もあるようです。目的はInfusionやGeneartのと同じですね。

(無題) 削除/引用 No.1520-19 - 2013/03/29 (金) 07:54:43 - うん アラビノースで誘導できるRedの遺伝子が必要ですが、組み込み自体はそのRedをつかって相同組換えで行けると思います。アラビノース誘導のRedは買うと結構高いかもしれません。 確か、３０くらいのPCRをライゲーションして発現ベクターのセットを作るのが目的だったと思います。組み換え用の大腸菌を作るところから始めることになりますが、今回一回限りなのか、今後ルーチンに遺伝子操作をするのかが、リガーゼやin-fusionを使うかの分かれ道でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1520-18 - 2013/03/28 (木) 22:00:00 - びん ”Redをゲノムに入れる”方法の詳細を教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1520-17 - 2013/03/28 (木) 21:47:37 - びん １３万円！！キャンペーン価格のときのIn fusionクローニングと比べて、割高すぎます。 それから次のような事から、利用範囲も限定されそうですね。 http://www.funakoshi.co.jp/contents/784 購入時のご注意 本製品は， 大学・官公庁研究所（ Academic ）にご所属の方のみご購入いただけます。また， ご購入に際して事前にライセンス使用許可が必要です。詳細は，サブライセンス確認書をご覧下さい。 ※営利団体・企業（ Commercial Entity ）にご所属の方が Red / ET Recombination テクノロジーを使用するためには， メーカーとのライセンス契約を締結していただくほか， ライセンス料が別途必要となります。詳細は当社テクニカルサポート（試薬担当： 下記参照 ） までお問い合わせ下さい。

(無題) 削除/引用 No.1520-16 - 2013/03/28 (木) 03:20:07 - うん 高いですが売ってますね http://www.funakoshi.co.jp/catalogs/%E8%A9%A6%E8%96%AC/%E9%81%BA%E4%BC%9D%E5%AD%90%E5%B7%A5%E5%AD%A6/%E3%82%B2%E3%83%8E%E3%83%A0%E8%A7%A3%E6%9E%90/7405

(無題) 削除/引用 No.1520-15 - 2013/03/28 (木) 01:15:36 - うん Redをゲノムに入れるだけなので、ppy株を作るのは簡単、と思ってみたり。

(無題) 削除/引用 No.1520-14 - 2013/03/27 (水) 22:48:49 - びん ppy株の分与を依頼するメールを送ったら、ライセンスが最近変更され、海外へは株そのものの分与はせずに、エキストラクトをドライアイスと共に発送する事になったという回答をもらいました（またMTAフォームのやりとりも必要です）。 そのため、既に、ppy株をもっている人はともかく、これからの人にはSLiCEは実用的では無いと考えられます。

メーカーさん涙目ですね。 削除/引用 No.1520-13 - 2013/03/22 (金) 23:04:49 - infusion 案様 ＞�Bでppy strainにtransformする事で効率は飛躍的に 上がります。しかし、当方ではもっぱらDH10Bで組換えを行なっています が、効率に問題を感じた事はありません。ppy strainはRED発現用として 分譲して頂けるので、特に樹立の必要はないかと思います。 ※以前当方もIn-Fusionを用いて組換えを行なっていました。しかし完全に 　置き換えて使用出来るどころか、むしろ高効率です。特に難しい操作は 　ありませんので、一度お試し下さい。本当に助かってます。 情報ありがとうございます。 cellytic Bもただの両イオン性界面活性剤ですが失敗するくらいなら、たいして量も使わないので買っちゃっても良いですね。 うちでも系を立ち上げたいと存じます。

(無題) 削除/引用 No.1520-12 - 2013/03/21 (木) 07:53:53 - 案 >>infusion様 この論文で樹立しているppy株はRED発現系を大腸菌genomeに組み込んで います。作者に依頼すればppy株を分譲して頂く事が出来ると思います。 SLiCEを使った組換えの手順としては �@ppyを培養してREDを誘導、粗精製 �Avectorとinsertのmixにppy extractを加え1時間反応 �Bcompetent cellにtransformation(ppy strainまたは他の菌株) という流れです。�Bでppy strainにtransformする事で効率は飛躍的に 上がります。しかし、当方ではもっぱらDH10Bで組換えを行なっています が、効率に問題を感じた事はありません。ppy strainはRED発現用として 分譲して頂けるので、特に樹立の必要はないかと思います。 ※以前当方もIn-Fusionを用いて組換えを行なっていました。しかし完全に 　置き換えて使用出来るどころか、むしろ高効率です。特に難しい操作は 　ありませんので、一度お試し下さい。本当に助かってます。

(無題) 削除/引用 No.1520-11 - 2013/03/19 (火) 11:35:30 - 案 >>Sliceでも組み込む断片にselection markerとか入れてselectionをすれば、プラスミド切断する必要もないのですかね？ 試してみました。問題なく組換え出来ますね。 お試し下さい。

全30件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---