BioTechnicalフォーラム [細胞障害活性（％）の算出方法について]

細胞障害活性（％）の算出方法について

No.1517-TOPIC - 2013/03/06 (水) 16:19:51 - さっちょん

お忙しい中、宜しくお願い致します。

当方、現在とある抗体のＡＤＣＣ活性を測定しております。
ターゲット細胞(以下（Ｔ）)は
接着細胞に(抗体のターゲットとなる)膜タンパクを発現させたもの。

エフェクター細胞(以下（Ｅ）)は、
ＰＢＭＣより培養した“主にＮＫ細胞”の集団を使用しています。(今後ＮＫを単離して使用する予定)
測定は、障害細胞からリリースされたＬＤＨの活性から得られた吸光度を用いています。

さて、表題の件なのですが
細胞障害活性の計算式を論文や測定キットを参考に見ますと、

[【(T)+(E)+抗体の吸光度】-【(T)の自然放出LDH由来の吸光度】]÷[【(T)の界面活性剤による最大遊離LDH由来の吸光度】-【(T)の自然放出LDH由来の吸光度】]

と、なっております。
実験で得られた測定値から、(T)のspontaneousなLDH放出量を引いた値が、真の測定値である・・・ということと思いますが・・・

実際実験をしてみると、
(E)からもLDHの放出がありますし、
抗体を反応させない、(T)+(E)のみの反応wellにおいては
(T)単独、（E)単独のspontaneous LDHの放出よりも測定値が高くなっています。

つまり、
抗体非存在下でも、(E)(T)を混ぜるだけでわずかですが細胞が死ぬのです。
そのため、
当方は上記の式ではなく、
(E)(T)(抗体)測定値-(E)(T)のspontaneous放出の測定値
を、分子にして計算していますが・・・・

この場合、分母は上記式のままでいいでしょうか？？

(E)と(T)を混ぜたwellに界面活性剤を処理することで得る値は、
当たり前ですが（E)由来のLDHも多く含まれますので、
本来測定したい(T)由来のLDHを評価するのに適さないのでは・・・
と、思い始めると頭が混乱してきました。
計算に弱くてお恥ずかしいです。
細胞障害活性についてご存じの方、
計算方法についてアドバイスをお願い致します。

また、多くの参考文献が
最初に書きました式を採用しているところをみると、
(E)を混合したことで多少の放出増大があっても、
無視しているということでしょうか？

乱文乱筆失礼いたしました。
　

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当初の計算式を採用してみます

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No.1517-9 - 2013/03/07 (木) 17:37:44 - さっちょん

＞おお様

何度もありがとうございます。

当初の予定通り(？)
実際の測定値から、E/Tのspontaneous LDH releaseを引いた値を分子とし、
分母はtarget cellのMax releaseとspontaneous releaseの引き算で
やってみます。

明らかにその計算じゃ、ダメだよ！！

という指摘がくるのではと
不安でしたが、
一応これでも大丈夫そうだということで
進めていこうかと思います。

多くの論文で分子の引き算に、target cellのspontaneous releaseを
用いているのは、
やはりそれだけE/Tmixのリリースが無視できるレベルなんだということ
なんですかね・・

当方の実験では、
かなりシビアな差を見ているmutantもあるので、
気になっていた部分でした。

閲覧下さった皆様も
ありがとうございました。

TaKaRa　LDHのキットを使用しております；

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No.1517-8 - 2013/03/07 (木) 17:31:42 - さっちょん

＞qq様

お恥ずかしながら、
当方、LDHのリリース実験には、
市販のキット(細胞障害活性を測定するもの)
を、用いております。

試薬AとBを混ぜて、反応試薬Cをつくり、
これを、LDHが放出されているであろう培養上清と反応させて
吸光度を測定する、というものです。

測定用の培地には、
おっしゃる通り血清だとバックが高くなったため、
BSAを使用しています。

抗体無しでもリリースが増えるという点では、
確かにコントロールが適切でなければ、
バックに変な値の含まれた部分を見てしまっているかもしれません。

アドバイスありがとうございました。

(無題)

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No.1517-7 - 2013/03/07 (木) 17:18:19 - おお

[【(T)+(E)+抗体の吸光度】-【(T)+(E)+抗体の吸光度 without抗体の吸光度】]÷[【(T)の界面活性剤による最大遊離LDH由来の吸光度】-【(T)の自然放出LDH由来の吸光度】]

でなくて

[【(T)+(E)+抗体の吸光度】-【(T)+(E) without抗体の吸光度】]÷[【(T)の界面活性剤による最大遊離LDH由来の吸光度】-【(T)の自然放出LDH由来の吸光度】]

でした。

(無題)

削除/引用

No.1517-6 - 2013/03/07 (木) 15:55:37 - おお

[【(T)+(E)+抗体の吸光度】-【(T)+(E)+抗体の吸光度 without抗体の吸光度】]÷[【(T)の界面活性剤による最大遊離LDH由来の吸光度】-【(T)の自然放出LDH由来の吸光度】]

【(T)の界面活性剤による最大遊離LDH由来の吸光度】-【(T)の自然放出LDH由来の吸光度】はEを入れないものを用意してはかる。

培養環境が変われば少し変わってくるかもしれませんので得られたあたいは実際のあたいからずれるとはおもいますが、一応これで出るんじゃないでしょうか。

あとは大きなずれがないかなんらかの傍証があればものいいがついてもディフェンスできるんじゃないでしょうか。

(無題)

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No.1517-5 - 2013/03/07 (木) 15:08:26 - qq

LDHの測定は、乳酸とNADを基質にして生じるNADHを使って発色させているだろうと思いますが、
あなたの見ているLDH活性は、本当に「乳酸とNADを基質にして生じるNADH」を見ているのでしょうか？
そのあたりのコントロール（乳酸なし、NADなしなど）は、適切にとってあるのでしょうか。
まあ、細胞がちぎれればLDHは漏れてくるでしょうから、バックグラウンドがゼロと言うことはないかもしれません。
溶血した血清には赤血球のLDHが混ざっているので、ここも注意した方が良いかもしれません。

コントロール抗体との比較もしているのですが・・・

削除/引用

No.1517-4 - 2013/03/07 (木) 13:55:20 - さっちょん

＞おお様

ありがとうございます。
ボスの意向としては、
細胞障害活性（％）を出したいようです。

一応コントロールIgG1を用いての比較実験の結果、
目的抗体のADCC活性は確認できています・・・
と、いうよりも、ADCC活性を持つことがすでに知られている抗体です；

実験の目的が、
抗体のADCC活性そのものというよりも、
ある薬剤処理によってのADCC活性の変化
抗体の標的マーカーの変異によるADCC活性の変化
というところに重きがありまして、
そのため単純にADCC活性がある、ないというだけではなく、
＜何％＞という数値が必要になるようです。

ADCCの測定についてはボスも手探りの部分があり、
同様の質問をしましたが

【論文ではtarget細胞だけの値でみているんだし、
それでいいんじゃないの？】

とのことで・・・
(つまり、質問本文中の、
＞(E)を混合したことで多少の放出増大があっても、無視している
という案を採用すればということで・・・)

ずれた返答でしたらすみません。
引き続き、障害活性％の算出方法に関して、
アドバイスをよろしくおねがいいたします。

(無題)

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No.1517-3 - 2013/03/07 (木) 09:17:20 - おお

%あるいは、全体のうちどれだけの細胞が死んだという数字を出さなければいけませんか?

たとえばノンスペシフィックな抗体とその抗体の比較でLDHの放出量を比較しただけでは用を足しませんか?

質問文の一部訂正

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No.1517-2 - 2013/03/06 (水) 16:22:12 - さっちょん

すみません、（％）なので、
式には×100をしています。

細胞障害活性（％）の算出方法について

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No.1517-1 - 2013/03/06 (水) 16:19:51 - さっちょん

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