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(無題) 削除/引用 No.1514-4 - 2013/03/06 (水) 23:35:25 - IPPPPP おおさん コメントありがとうございます。 次回の実験ではハミルトンシリンジで洗浄時のbufferをしっかり取り除いて、通常の１XSDS bufferを使って蛋白を溶出してみます。 もし問題があれば、塩濃度含めて条件を検討してみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1514-3 - 2013/03/06 (水) 03:21:01 - おお あとは塩濃度とバッファーのもちこみかなぁ。。。SDSPAGEのバッファーけいにもよると思いますが、150mMほど塩が入ると若干解像度が鈍るようなきがしてます。 低塩濃度のバッファー(バッファーも濃度が高い必要はないとおもう)で最後に洗えば塩の影響などはさけれますね。

(無題) 削除/引用 No.1514-2 - 2013/03/06 (水) 03:10:26 - おお ある程度のSDSがあれば抗体からサンプルが放出されます。くわえて過熱もすると思いますので、0.5%位あればOKです。ライセートにサンプルバッファーを加えるのではないので、SDS量がタンパクに対して少なすぎるということはないと思います。あとは還元剤が薄すぎてジスルフィド結合がはずせない可能性を考えたほうがでしょう。 それと感度などの問題でできるだけたくさんのせたいときと、そんなに意識しなくても十分検出できるときなどで対応が変わるかもしれませんね。

免疫沈降時のsample bufferの濃度と量 削除/引用 No.1514-1 - 2013/03/06 (水) 02:52:43 - IPPPPP 最近、免疫沈降(Co-IP)に取り組み始めたものです。 手技に関して質問があります。 抗体ーアガロースビーズ複合体から蛋白を溶出する時のsample bufferの濃度と量には何か決まりがあるんでしょうか。 ネット上でいくつかのプロトコールを比較してみましたが、最後の複合体からターゲット蛋白を溶出する時のSDS bufferの濃度、量がまちまちなのが気になりました。 ひとつのプロトコールでは、蛋白lysate 100ug、抗体1ugに対してプロテインA/Gアガローズビーズ懸濁液20ul(うちビーズは25%)を加えて、最終的に40ulの1Xsample bufferを加えています。(サンタクルズ） 別のプロトコールでは、蛋白lysate 200ul、抗体2.5ugに対して、アガローズビーズ懸濁液60ul(うちビーズは50%)を加えて、最終的に50ulの2Xsample bufferを加えています。(amsbio.com) その他、見比べてみましたが、 ビーズの量（＋隙間にはいった(推定)lysis buffer量）に応じて調節しているかというと、必ずしもそうでないようでした。 sample bufferの濃度(1x,2xなど）の使い分け、またその量はどのようにして決めているのでしょうか。 よろしくお願いします。

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