全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

PreAmp 削除/引用 No.1503-7 - 2013/08/19 (月) 23:32:03 - 悪地蔵 Life TechnologyのPreAmpを使用したことがあります。 ただ、qPCRはTaqMan Assay onlyになりますので経済的には 優しくないものになります。 TaKaRaで販売しているRNA増幅試薬もありかもしれませんが 増幅にバイアスがかからないという保証が無いのはどの方法も 一緒と思います。

試行したことは 削除/引用 No.1503-6 - 2013/03/06 (水) 13:33:15 - ema 私は、アレイがメインでしたのでcDNAの増幅キットではなく、RNA（cRNA）増幅で行っていました。アレイの残りのcRNAでリアルタイム確認してね、というスタンスで行っていました。当時のAffy,Agilでの推奨だったからかAmbionメインでした。 一番少ないものが300pg/totalで２回まわして数ｕｇ単位の経験があります。（細胞数は１０３単位） 一応 MessageAmp ExpressArt mRNA Amplification Kit WT-Ovation™ RNA Amplification System を試していて、 MessageAmp ExpressArt mRNA Amplification Kit はそんなに遜色ない。キット説明からいくとExpressArtのほうが壊れているかもを加味するといいかも。 Ovationは壊れているサンプルのために試しましたが非常に癖のあるデータでになりました。（Ovationで濃度振りやRNAをわざと劣化させたとか色々やりOvation同士では定量、再現性はあるのですが他のキットデータとはちがう癖がでました）

(無題) 削除/引用 No.1503-5 - 2013/03/05 (火) 09:02:07 - カツカツ 皆様 貴重なアドバイスありがとうございます。 ＞おおさま deep-seqも平行しておこなっているのですが、 私たちの部署の技術的な問題で、結構時間が掛かりそうで、 結局はqPCRが必要という判断になりました。 ＞YYさま EpicentreのMessageBoosterというキットを試したことがあり、 それなりに満足できる増幅が見られたことがあります。 QuantiTectは出発RNAが10ngということで見送った経緯があります。 ご使用の経験はあられるでしょうか？ >emaさま 確かに直接Lysisするのは純度という点で良さそうです。 AmbionのMessageAmpはチェックしていませんでした。 他社の増幅キットと比べての感触などありますでしょうか。

ｍRNA増幅 削除/引用 No.1503-4 - 2013/03/04 (月) 11:57:46 - ema 非常に少なくソートを使用しているということで、まずSort細胞は直接Trizol LSなどのRNA抽出試薬にとるとあまり壊れていない品質の良いRNAが回収されると思います。 比較的安いのは、RNAでｍRNA（壊れ率が高いと結果が変わってきますが）の増幅T7法でambionのMessageAmp™ Kits（いまだとLife Teｃが版権もっているかも）で1回1000倍2回までOKでやっていました。 T7プライマーの所が壊れてるとその遺伝子は検出できないのと、増幅時に多いものほど増幅されやすいバイアスがかかるのを承知で検出します。 増幅していないサンプルと増幅サンプルは単純比較しないでください。

(無題) 削除/引用 No.1503-3 - 2013/03/02 (土) 23:52:23 - YY キアゲンからQuantiTect Whole Transcriptome KitというcDNAを増幅するキットが売ってますよ。結構いい値段ですが。。。

(無題) 削除/引用 No.1503-2 - 2013/03/02 (土) 04:42:12 - おお 一層のことdeep sequencingしてしまえば、すべての発現プロファイルが得られるのではとおもったり。。。

qPCR, 出発材料が少ない場合の工夫 削除/引用 No.1503-1 - 2013/03/02 (土) 00:58:22 - カツカツ いつもお世話になっています。 現在の研究において、ソーティングで得られたヒト血液由来の希少細胞の機能解析のため、 qPCRによる遺伝子発現解析を頻繁に行う必要があります。 本格的な解析の前にプレ実験を行いましたが、 10,000細胞程度からだと得られるtotalRNAも5 ngと少なく、 当然Ct値も常に30-35となってしまいます。 また、解析できる遺伝子数も限られてしまうのが悩ましい限りです。 このような量の限られた細胞を対象にqPCRを行なっている方がおられましたら、 上記のような問題点を少しでも改善するために気をつけていること、 オススメのキットなど、pre-amplifyに関してなど、 なんでも良いですのでアドバイスを頂けないでしょうか。 よろしくお願いします。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---