ちょうどうちではPEG6000でPEG沈を行っています。
産物が短いほどロスする可能性は高くなります。200bpくらいまではうまくいっていますが、100は難しいかもしれません。
以下がうちのラボでのプロトコルです。
PEG溶液(20% PEG6000, 2.5M NaCl):
PEG6000を 20 g、NaClを 14.6 g 、milliQで 100 ml にメスアップ後オートクレーブ滅菌。分離していることがあるので振り混ぜてから常温保存。オートクレーブ前はPEGがかなり溶け残りますがある程度撹拌したらそのままメスアップしています。
PCR産物 18 ul にPEG溶液 12 ul を加えてvoltex
4°C 1h 静置
遠心(プレート)2,810×g 10°C 40min/(チューブ)12,000×g 室温 5min
液層を捨てる
滅菌水に溶解
念のため冷却していますが、十分なgがかけられるなら室温でも可能だと思います。
PEG沈はエタ沈に比べてペレットがもろくロスしやすいです。特にプレート遠心では。
確実性を求めるなら1.5mlチューブでの遠心をおすすめします。
QIAGENのゲル抽出はなぜかBigDyeの反応のみ失敗していたので相性の問題だと感じていました。
液体のPCR産物精製キットではうまくいっており、愛用していたのですが。
なにぶん古い話ですし、当時私の腕が悪かっただけかもしれません。 |
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