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(無題) 削除/引用 No.1498-12 - 2013/03/05 (火) 22:37:18 - ぽにゅ せqがかり様 重ねての情報をありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1498-11 - 2013/03/05 (火) 10:19:42 - せqがかり ちょうどうちではPEG6000でPEG沈を行っています。 産物が短いほどロスする可能性は高くなります。200bpくらいまではうまくいっていますが、100は難しいかもしれません。 以下がうちのラボでのプロトコルです。 PEG溶液（20% PEG6000, 2.5M NaCl）： PEG6000を 20 g、NaClを 14.6 g 、milliQで 100 ml にメスアップ後オートクレーブ滅菌。分離していることがあるので振り混ぜてから常温保存。オートクレーブ前はPEGがかなり溶け残りますがある程度撹拌したらそのままメスアップしています。 PCR産物 18 ul にPEG溶液 12 ul を加えてvoltex 4°C　1h　静置 遠心（プレート）2,810×g　10°C　40min／（チューブ）12,000×g　室温　5min 液層を捨てる 滅菌水に溶解 念のため冷却していますが、十分なgがかけられるなら室温でも可能だと思います。 PEG沈はエタ沈に比べてペレットがもろくロスしやすいです。特にプレート遠心では。 確実性を求めるなら1.5mlチューブでの遠心をおすすめします。 QIAGENのゲル抽出はなぜかBigDyeの反応のみ失敗していたので相性の問題だと感じていました。 液体のPCR産物精製キットではうまくいっており、愛用していたのですが。 なにぶん古い話ですし、当時私の腕が悪かっただけかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1498-10 - 2013/03/04 (月) 19:52:28 - ぽにゅ せqがかり様 情報をありがとうございます。 シリカメンブレンはキットによってあたりはずれがありそうですね。キアゲンってブランド力はありそうなのですが、プロメガの方が良かったのですね。 幸い、冷却機能はないものの、プレート遠心機はあるので、ペグ沈を試みたいと思います。100bpとか300bpぐらいの短いPCR産物でも大丈夫であれば良いのですが。 ペグ沈は名前はしっていても実施した事がありません。ネット検索すると次がありました。 http://homepage1.nifty.com/genomic_art/protocols/PEG-chin.htm もし異なるプロトコルを実施されている場合には、詳細を教えてください。 また当方の手元には別目的で購入したPEG6000がたくさんあります。PEG8000でなくてもよいか、もし御存知でしたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1498-9 - 2013/03/04 (月) 11:57:46 - せqがかり Genelute Agarose Spinは使用したことがないので、それ以外の方法を。 一番安価な方法はPEG沈だと思います。 一番手間が少ないのはExoSAP法です。混ぜてインキュベートするだけです。 どちらもバンドがきれいに増えている場合にしか使用できませんが、ゲル抽出は必要ありません。 切り出してゲル抽出の場合はPromegaのWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを使用しています。問題なくBigDyeで読めています。PCR産物を直接精製することもできます。 数年前ですがQIAGENのゲル抽出キットを使用したときはうまくいきませんでした。 BigDyeの場合、ゲルやバッファーの持ち込みのほうが反応を阻害する気がします。 コンタミも怖いので私は必要がない限りはゲル抽出はしません。 普段はPCR産物をPEG沈＋96wellプレートで精製してBigDyeの反応にかけています。

(無題) 削除/引用 No.1498-8 - 2013/03/01 (金) 02:15:00 - KEN 当方も、以前、これと似たMilliporeの製品でシークエンス反応を行なっていました。 もちろんTAEで泳動していましたが、シリカメンブレンカラム精製に比べると、きれいに反応が進まないこともありました。 私は、全検体、シリカメンブレンカラムで精製しています。　(正直、そこまでの精製グレードはいらないと思っていますが、ゲル切り出しをやらなくても、プライマーダイマーの除去がバッファーの濃度の調節で出来るのが便利なので。。。) 大量検体を行うから速くというならば、吸引マニフォールドを用いた精製を96ウェルプレートのNucleoFast® 96 PCR Clean-up Kitみたいな限外濾過で行うのが良いかと。

(無題) 削除/引用 No.1498-7 - 2013/02/28 (木) 20:36:57 - ぽにゅ シーケンス反応をしている別部署では、次のようにシーケンス反応をしているらしいです。 シークエンス反応 2.0μlのBig Dye Sequencing Buffer 3.2ulのプライマー1pmol/ulを PCR 産物 5-10ng/100bp （別記） 4.0μlのプレミックス(BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit) 　 滅菌水にて　計20μlにメスアップ 別記：送付に求められている条件 　PCR産物 (100-200bp) 1-3ng/ul　5ul 以上 　　　　　　　　　　　　 　PCR産物(200-500bp) 3-10ng/ul　5ul 以上 　　　　　　　　　　　　 　PCR産物 (500-1000bp) 10-40ng/ul　5ul 以上 　　　　　　 　PCR産物 (>2000bp) 20-50ng/ul　5ul 以上

(無題) 削除/引用 No.1498-6 - 2013/02/28 (木) 20:07:55 - ぽにゅ 中年様 シーケンス反応やシーケンス作業そのものは、別部署でやってもらうので詳細は判らないのですが、500bp程度なら3から10ng/ulが5ulぐらい、1000bp程度なら10ng/ulが5ulぐらいを送るように指示されています。またBigDyeは4ulを１回のシーケンス反応に用いるらしいです。 エタ沈をして、10分の１濃度TEに溶解した方が良さそうですね。

(無題) 削除/引用 No.1498-5 - 2013/02/28 (木) 19:51:10 - 中年 誤解があるといけないので確認しますが、Genelute Agarose Spinもバッファーはゲルに含まれているものがそのままの組成で持ち込まれます。その際、問題になるかも知れないのはEDTAです。シークエンスの反応に持ち込む容量が大きければ反応を邪魔する可能性もあるかと思います。 5ulを鋳型に使うとのことですが、シークエンスの反応はどの位の容量で行われますか。できれば、TAEの持ち込みは全体の1/10程度に抑えたいです。

(無題) 削除/引用 No.1498-4 - 2013/02/28 (木) 18:10:40 - ぽにゅ 中年様 早速の御回答をありがとうございます。以前にはゲルを透析膜に入れて泳動層で泳動をさせる事でDNAを溶出し、エタ沈をするという、効率の悪い方法をしていました。 なんとなくシグマ社のGenelute Agarose Spinは、それと同じような事を重力をかけてやっているだけのようなイメージがあったので、エタ沈をしないといけないのかなと思っていました。 なお泳動はTAEバッファです。 エタ沈をしなくても良いならば、安くて早い、Big Dye Terminatorのための泳動後の精製法という目的にかなっています。500bp程度なら3から10ng/ulが5ulぐらい、1000bp程度なら10ng/ulが5ulぐらい、あればBig Dye Terminatorでシーケンスをできるので。

(無題) 削除/引用 No.1498-3 - 2013/02/28 (木) 17:49:14 - 中年 すみません、ExoSAP-ITはillustra ExoStarにとって代わられたようですね。

(無題) 削除/引用 No.1498-2 - 2013/02/28 (木) 17:46:33 - 中年 精製の目的はdNTPとプライマーを除くためですので、問題なく使えると思います。もし、PCR産物がきれいなシングルバンドになるならば、ゲルで精製しなくてもExoSAP-IT処理でdNTPとプライマーを分解したものをシークエンスに使えます。

Genelute Agarose Spinはシーケンスに使えますか？ 削除/引用 No.1498-1 - 2013/02/28 (木) 16:07:58 - ぽにゅ よろしく御願いします。 PCR増幅産物をBig Dye Terminatorでシーケンスするための、安くて早い泳動後の精製法を求めています。 シグマ社のGenelute Agarose Spinはアガロース泳動してバンドを切り出して、カラムに入れてスピンするだけです。 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/dna-and-rna-purification/genelute-agarose-spin-columns.html http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Bulletin/56501bul.Par.0001.File.tmp/56501bul.pdf シリカメンブレンのカラム精製等よりもステップ数が少ないので早いそうです。用途としては、ライゲーション、PCR、制限酵素処理、標識、ハイブリなど、と書かれています。しかしシーケンスに使えるかどうかは不明記です。 そこで、Genelute Agarose Spinはシーケンスに使えるかどうか御存じの方、教えてください。シーケンス用にはもっと別の精製度の高そうな方法が必要なのでしょうか？それともBig Dye Terminatorは、一種のPCRのようなものなのだから大丈夫なのでしょうか？ よろしく御願いします。

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