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(無題) 削除/引用 No.1497-15 - 2013/03/01 (金) 22:18:17 - qうぇrちゅいおp PNGaseFみたく糖鎖を根本でバシって切る酵素で処理した時に分子量シフトがあるかどうかで、糖鎖の可能性は検証できるよ。混ぜてインキュベートするだけのすごい簡単な実験だよ。たとえばnew england biolabsのカタログみてみ。こういう関係の酵素をbufferとセットでいろいろ売ってるよ。 組織間でかなり違いがあるとなると、スプライシングバリアントっぽい雰囲気を感じるんだが。 DTTは溶液状態だと酸化されてあまり安定じゃないので、溶かしてから時間たったものはちゃんと還元できるかなあというのが心配。熱にも弱いし。こういう点ではbetaMEの方がまだいいとおもう。

(無題) 削除/引用 No.1497-14 - 2013/03/01 (金) 18:15:19 - KY 抗体が売っているのであれば、そのタンパク質の組織発現をチェックした論文ぐらいないのでしょうか？それを探す事が一番早いと思います。 Lamp1というリソソームの膜タンパク質は糖鎖修飾され、タンパク質自体50kDaぐらいのものが１００kDaに見られます。しかも組織によって、その糖鎖が違うためか、それぞれの組織では70-110kDaの間でバラバラです。 http://www.jbc.org/content/274/18/12692.long

(無題) 削除/引用 No.1497-13 - 2013/03/01 (金) 13:15:20 - おお へーおもしろそうじゃないですか。ノンスペの可能性をどうやって否定しますかという事ですね。 複数の抗体を使ってみるのがまあてがるですね。 たまに抗体がその蛋白のファミリー拾うことがあります。とうさ修飾やリン酸かならはずせるかもしれない酵素は売ってますけど。 まあ"う"さんがいっているように状況がわからない中でのサジェスチョンなのでどこまで当てになるかわかりませんけど。

(無題) 削除/引用 No.1497-12 - 2013/03/01 (金) 13:00:18 - ~ >ご意見をありましたら、ご教授ください。 最終的には何をしたいのでしょうか？ その100kDのシグナルが何かを知りたいのであれば、精製、切り出しを行い、MSを用いてアミノ酸配列および修飾の確認を行うといいのではないでしょうか。 それだけで同定はできないかもしれませんが、次のステップを考えるもとになるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1497-11 - 2013/03/01 (金) 10:48:30 - 直輝 ポジコンが出てるならいいじゃないですか。ウェスタンで目的のバンド以外のところにもバンドが出ることなんてよくありますよ。 既に指摘されてますが、未知のアイソフォームを疑うなら、抗体をもう一種買って、やはり同じバンドが出るか確かめると良いと思います。 一般的に言って、糖鎖だけで分子量が２倍になるとは考えづらいですね。

(無題) 削除/引用 No.1497-10 - 2013/03/01 (金) 10:32:07 - う 目的タンパク質の全体像が全くわからない私としては、 どういったらいいのか、膨大な可能性の前に辟易してしまいます。 そのくらい、考察しだしたらキリが無いことを 質問者様は、ここに丸投げにしているということを愚痴っときます。 さて、タンパク質の修飾による分子量の変化の件ですが、 それを言い出したら、キリがなく、 何のタンパク質か知らない私としては、何とも言いようがありません。 ただ、ひとつ、 データーシートで54kDaになるとか言われているタンパク質が 組織によって修飾されてるかも？と考える根拠は？ これ自体が新しい発見なのか？　　　 それとも、そういうことが言われてことがあるのか？ わかんないです。 私としては、まず、 その抗体がきちんと目的のタンパク質『だけ」を認識する優秀な抗体なのか？ を、いろいろ実験を考えて確認する必要があると思います。 売ってある抗体が、データーシートがあるからといって きちんとしたもので無いことがある、ということは ある程度の研究者であったら、知っていることです。 抗体のチェックを考えながら、 そのタンパク質についての既知の情報を整理して 考えることが、研究の面白さではないでしょうか。 それを、わかんないで済ませたら、何が研究なのでしょう。 と、どうでもいいですね、すみません。

(無題) 削除/引用 No.1497-9 - 2013/03/01 (金) 10:22:08 - qp ここでこれまでのようなやり取りをしても、 それは、質問者様が既に知っている事実を 知らない回答者が質問することで引き出し、 そして回答者は、その提示された「既知の事実」から また0から考え直しをしていく。 意味無し。もうちょっと質問の仕方考えようよ。

(無題) 削除/引用 No.1497-8 - 2013/03/01 (金) 09:47:26 - iimura ご回答をいただき、ありがとうございました。説明が不足で、すみませんでした。抗体のデータシートとNCBIのデータベースにより、目的蛋白は、54ｋDaと予測されています。肝臓の組織をPositiveとして、54ｋDaのBandが出ていますが。別の組織では、54ｋDaじゃなくて、100ぐらいにしっかり出ています。いろいろ調べて、今、糖鎖修飾か、isoformか、二量体かと考えていますが。二量体に関しては、DTT100ｍMで還元状態でやってみたが、サイズが変わらなかったので、二量体の可能性が低いではないかと思っています。ご意見をありましたら、ご教授ください。

(無題) 削除/引用 No.1497-7 - 2013/03/01 (金) 05:11:50 - おお 検出した蛋白の名前を公開すると具体的な指摘があるかもしれませんよ。 公開してもそちらの研究に差し支えなければですが。 サンプルバッファーで還元剤フリーで売っているものがあるみたいですが、サンプルバッファーに還元剤が入っていたのかチェックしてみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1497-6 - 2013/03/01 (金) 02:17:46 - qうぇrちゅいおp＠ なんか叱られてるみたいなので助けにきた。 あんまりこういうの詳しくないけど思いつく範囲でとりあえず書く。 まずこの抗体があてになるものかどうかなんだが。この蛋白質の抗体を（論文とかみてみんながつかってそうなやつを）取り敢えず２、３つ別のメーカーから買って試してみるのがいいな。出来ればポリクロを。そのうえで、この問題の究明にエネルギー使うべきかどうか考えるのがいいと思う。 SDS-PAGEの分子量が理論値より大きいことは、たまにあって、アミノ酸組成の偏りとか、スプライシングバリアントとか、糖鎖とかUBL関係の蛋白質のポリマーによる修飾とか、前駆体とかいろんな理由があるけど、過去にこの蛋白質を研究した他の人もたぶん同じ経験してるとおもうので先行研究があればそこに回答があるんじゃないかな。この分子量どうよってメールで聞いてもいいし。 で分子量が理論値の２倍なわけだがが、もしかしたらSDS-resistantなホモダイマー作りやすいのかな。またS-Sが切れにくいということもあるかもしれない。あと少数ながら非共有結合でも変性条件でも解離しにくいのもあるみたい。

まずは落ち着いては 削除/引用 No.1497-5 - 2013/02/28 (木) 13:06:05 - ~ >どう考えてよろしいでしょうか 今回使用した抗体は、今回泳どうした条件で100kDaの位置に来る物質と結合する、と考えればいいでしょう。 >また、どうやって証明したら、よろしいでしょうか？ 基本的には、分子量マーカーと一緒に流して撮影した記録があれば、証明になるでしょう。 対外的な証明であれば、実験ノートの記録を示したり、再現性を第3者に調べてもらう場合もありますが。 >54ｋDaになるはずです。 そのデータベース上のデータと、今回の実験操作の関係を確認しましょう。 >マウスにも発現する可能性があるでしょうか？ はい。アイソフォームは様々な種で発現している可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.1497-4 - 2013/02/28 (木) 12:42:11 - Q >マウスの組織を使っていますが。データベースにより、マウスの場合は、54ｋDaになるはずです。くまだと、96ｋDaになる。くまに発現するisoformは、マウスにも発現する可能性があるでしょうか？ 言っていることが、支離滅裂。

(無題) 削除/引用 No.1497-3 - 2013/02/28 (木) 12:32:40 - おお >[Re:1] iimuraさんは書きました : > 生物学の初心者です。Westernで検出されたバンド（約100ｋDa)が予測されたサイズ（54ｋDa)より大きくなっています。（しっかり、ひとつのバンドです。）どう考えてよろしいでしょうか、 予測ってどうやって予測したんでしょうか。。。 まあ理屈はしっかりともって欲しいですが、抗体売っている試薬屋さんのホームページやカタログ見るとどこにバンドが検出されるか、イメージ付きでのってたりします。手持ちの抗体の購入先でなくてもいいから探してみてはどうですか?加えて会社によって微妙にサイズが違ったりもします(質問される前に指摘しておきます). >また、どうやって証明したら、よろしいでしょうか？ご教授してください。 実験やその系がどの様にいままでエスたブッシュされてきたのかがわかりませんのでお答えしても役立つかどうかわかりません。 > > 追加：マウスの組織を使っていますが。データベースにより、マウスの場合は、54ｋDaになるはずです。くまだと、96ｋDaになる。くまに発現するisoformは、マウスにも発現する可能性があるでしょうか？ 遺伝子はどの様に発現するのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1497-2 - 2013/02/28 (木) 12:11:56 - qp まずは、身近にいる担当教官、先輩に聞く。 そうしていないなら知ろうとする手段と思考回路がおかしいことに気づくベキ。 基本のことが頭にあるのか？ アミノ酸配列からの予想される分子量とwesternで検出される分子量は同じとは限らない これ、常識。 あとは、 使っている抗体のデーターシートを見る。 同じタンパク質を扱っている論文を見る、使っている抗体、westernの結果を見る。 可能ならノックダウンをしてみる、ノックアウトマウスを用いてみる。 この辺は、教えてもらうのではなく、自分で考えても思いつくはず、 いや思いつかないと研究しているとは言わない。

バンドが予測サイズより大きい、どうしたらいいでしょうか？ 削除/引用 No.1497-1 - 2013/02/28 (木) 11:41:01 - iimura 生物学の初心者です。Westernで検出されたバンド（約100ｋDa)が予測されたサイズ（54ｋDa)より大きくなっています。（しっかり、ひとつのバンドです。）どう考えてよろしいでしょうか、また、どうやって証明したら、よろしいでしょうか？ご教授してください。 追加：マウスの組織を使っていますが。データベースにより、マウスの場合は、54ｋDaになるはずです。くまだと、96ｋDaになる。くまに発現するisoformは、マウスにも発現する可能性があるでしょうか？

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