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(無題) 削除/引用 No.1485-22 - 2014/03/04 (火) 17:15:09 - これは 1年前のですよ

(無題) 削除/引用 No.1485-19 - 2013/03/05 (火) 22:43:12 - びん 通りすがり さん いまひとつGatewayの原理ができなかったので、メーカーに質問がてら相談をしました。その結果、当方では、プラスミドライブラリになっていないcDNAである事、用いるベクターが決まっている事、C末などにできるだけ余計な配列を加えたくないことなどが理由で、Gatewayは推薦できないというのがメーカーの見解でした。

Gatewayはどうですか？ 削除/引用 No.1485-18 - 2013/03/05 (火) 12:17:10 - 通りすがり 話を混ぜ返すようですみませんが、このスケールで、初心者を動員してプロジェクトをくむのであれば、PrimeStarGXL(or KOD plus Neo) + Gatewayの組み合わせが、ワークフローとしてかなり安定するように思います。 いずれにしろきっとプライマーが長くなるので、オリゴのクオリティも少し気にした方が良いかもしれません。値段と品質のバランスから、以前はIDT（MBL)に頼んでいましたが、最近はどうなんでしょうか。 逆に質問みたいになってすみません。

(無題) 削除/引用 No.1485-17 - 2013/03/03 (日) 23:22:02 - YY > 制限酵素で切らないプラスミドをテンプレートにできるという事は、目から鱗です。アニールしたオリゴの3'末から一周して相補鎖を伸ばしてきたPCR酵素がその同じアニールしたオリゴの5'末に到達して、新しい環が完成するという事ですね。 そういうことです。 > またPCRで増やすので、プラスミドのoriでなくても複製開始の部位はどこでも良いという事ですね。またプライマー２つがそれぞれアニールする場所は、離れていればどこでも良いけど、MCSの近辺にしていらしゃるという事ですね。 どこでも構いません。私は使い勝手がいいのでMCS付近でプライマーを設計しております。 > 必要な収量にもよりますが、ミニプレップしなくても良いという事になりますね。 そういうことです。In fusionでクローニングする際にベクター側が50 ngほど必要になるので、PCRで作っているだけです。ただし、下の方も言われておりましたが、PCR産物は電気泳動で精製した方がよいです。またIn fusionの反応は相同組換えによるものですが、ベクターとインサートがくっついているだけで、ライゲーションされた訳ではないので、これをテンプレートにしてPCRで確認することができませんので、形質転換した後、コロニーPCRなどでチェックする必要があります。 研究が上手くいくといいですね。

(無題) 削除/引用 No.1485-16 - 2013/03/03 (日) 22:52:21 - びん YYさん 早速の御回答をありがとうございました。 制限酵素で切らないプラスミドをテンプレートにできるという事は、目から鱗です。アニールしたオリゴの3'末から一周して相補鎖を伸ばしてきたPCR酵素がその同じアニールしたオリゴの5'末に到達して、新しい環が完成するという事ですね。 またPCRで増やすので、プラスミドのoriでなくても複製開始の部位はどこでも良いという事ですね。またプライマー２つがそれぞれアニールする場所は、離れていればどこでも良いけど、MCSの近辺にしていらしゃるという事ですね。 必要な収量にもよりますが、ミニプレップしなくても良いという事になりますね。 ありがとうございます。勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.1485-15 - 2013/03/03 (日) 22:05:48 - YY びんさん こんばんは。 （１）プラスミドは制限酵素で切っていないものをテンプレートにしています。酵素はPrimeSTAR Maxです。気をつけるのはあまりにもそれぞれのプライマーの3'側が近すぎると増えにくい事があります。つまり輪っかのテンプレートの外側に向かって増えていくので、プライマーの距離が近すぎるとアニーリングしにくい事があります。なので私はクローニングサイトのそれぞれ一番端の制限酵素サイトを含む様に設計しております。上手く増えなかった場合は真ん中にある制限酵素で切ったものをテンプレートとしています。PrimeSTAR Maxを使った場合、最速5 sec/kbpで伸長できますが、15 sec/kbpでやった方が収量が良いです。またテンプレート量はあまり沢山入れると増えにくいので100 pgぐらい使っています。Denatureやアニールの温度と時間はマニュアルに従っています。マニュアルのpdfです。 http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFFiles/R045A_j.pdf ところで、pUCを使われるとありますが、HEK293での発現を目的としているのであれば、HEK293導入に使うプラスミドにダイレクトにクローニングすることができます。当方、8 kbpぐらいのプラスミドを増やしたりしていますが、特に問題はございません。 （２）In fusionクローニングでは15 bpほどの相同な領域が必要です。この15 bpをインサートの5'と3'側に付加しないといけないので、増えにくいかと思い、2段階でPCRを行っております。別にいきなりこのプライマーを使って増えるのであれば、1段階PCRで結構です。 PCRを２段階で実施するという事ですが、何ベースぐらい外側で最初のPCRをするという基本的な考え方はあるのでしょうか？とのことですが、特に何bpでも構いません。私は2回目のPCRでノンスペが増えていないかを電気泳動で確認するために、200 bpぐらい小さくなる様にしています。 どちらのPCRも30サイクルほどでやっています。サイクル数を増やす程、ミューテーションが入る確率が上がるので、心配なときは一回目のPCRが増える事を確認した後、15サイクル程度PCRをかけたものをテンプレートとして2nd PCRを行っています。 通常の制限酵素で切ってライゲーションでも2回PCRが必要か？と言う事ですが、制限酵素サイトを入れたプライマーで増えればそれで結構です。増えなかった場合、外側にプライマーを設計してPCRを行い、それをテンプレートにもう一度PCRやっています。

(無題) 削除/引用 No.1485-14 - 2013/03/03 (日) 12:56:30 - びん YYさん 情報をありがとうございます。 ２つ教えてください。ベクター側とインサート側それぞれについてです。 （１）制限酵素で切ったプラスミドをPCRで増やす点で何か注意点はないでしょうか（Denatureやアニールの温度とか時間とか）？まずどのPCR酵素を使われているのでしょうか（文脈からはPrimeSTAR Maxのようですけど）？現代のPCR酵素なら、プラスミド程度の長さ（約３kbp）のものを増やせるという事は理解していますが、単なる長い２本鎖DNAと違う難しさは特にないのでしょうか？なお当方はプラスミドとしてpUC19を使う予定です。 （２）”In fusionでクローニングするためのプライマーに余分な配列をつけているので増えにくいかと考え”、PCRを２段階で実施するという事ですが、何ベースぐらい外側で最初のPCRをするという基本的な考え方はあるのでしょうか？それから１回目と2回目のPCRのサイクル数はそれぞれ何回ぐらいずつでしょうか？このような２段階のPCRは、制限酵素で切ってライゲーションをするというストラテジーでも必要なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1485-13 - 2013/03/02 (土) 23:46:49 - YY もうすでに解決されているかもしれませんが、 私はPrimeSTAR MaxとIn fusionクローニングキットを使っています（Takaraの回し者ではございません）。 PrimeSTAR Maxは1 kbpあたり、5秒で伸長できるのでかなり早くできます。 私の場合は4 kbpとかを増やしたりしているのですが、増えなかったという事は経験しておりません。 実際は 20 micro Lの反応系で、Total RNA 1 micro g使って逆転写を行い、それを1 micro L使って50 micro LでPCRをしています。In fusionでクローニングするため、プライマーに余分な配列をつけているので、増えにくいかと考え、最初のPCRは目的のORFよりも外側でプライマーを作成しております。 その反応液の一部を1000倍希釈し、残りは電気泳動で増幅の確認をしています。 次に希釈した反応液を1 micro L使って2nd PCRを行います。この時のプライマーはIn fusionクローニングに必要な配列をつけています。 他の方も指摘されていますが、In fusionクローニングは結構ベクターの量が必要なので、PCRでベクターを増幅しています。 あと、In fusionは結構高いので、けちって4分の１の系でやっています（つまりトータルで2.5 micro L）。これを全部使って大腸菌へ形質転換しています。 In fusionにもCloning Enhancerとかが付いたのが売っていますが、使った感じあんまり効果的では無かったので、PCR産物は電気泳動後、精製しています。

(無題) 削除/引用 No.1485-12 - 2013/02/28 (木) 05:28:45 - びん おおさん ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1485-11 - 2013/02/28 (木) 02:23:31 - おお >[Re:9] びんさんは書きました : > 従来法の中でも、おおさんのブラントエンドを用いた方法は、かなり使えそうです。この方針でやってみようと思います。 PCRのフラグメントはいずれにせよゲル抽出した方がいいよ。見えない程度でも短いものがあればそちらのほうがライゲイションにゆうりだから。

(無題) 削除/引用 No.1485-10 - 2013/02/26 (火) 22:48:50 - KEN ちょっと、正確性とは離れた発言ですが。。。 Tks GflexとKODだと、私の実験系では、KOD FX NEOの方が、PCRの成功率がよかったです。 ExTaqよりは断然、成功率は良いのですけどね。

(無題) 削除/引用 No.1485-9 - 2013/02/26 (火) 20:51:07 - びん ajiさん、おおさん、monさん 貴重な御意見を誠にありがとうございます。 ajiさんとmonさんの御体験をふまえた御教授は、非常に勉強になりました。In fusionクローニングではなく、従来法を用いる事にします。 従来法の中でも、おおさんのブラントエンドを用いた方法は、かなり使えそうです。この方針でやってみようと思います。 ありがとうございました。

Infusion 削除/引用 No.1485-8 - 2013/02/26 (火) 10:28:24 - mon Infusion法で気がついたことをコメントします。 原理は、3'-5'exonuclease活性で一本鎖部分を作り出し、相補鎖でハイブリさせ、大腸菌内で修復・連結させています。 (1)同じコロニー数を得るにはDNA(vector,insertともに）は通常のligation法に比べ多く必要(~10倍~？）。したがってライブラリー作製には向いていない。 (2)KitのManual通りだと反応液が余るし高価なので、1/3~1/2volで行なっている。 (3)insertはfreshなものが良い。その意味は、fidelityの高いPCR酵素を用いたPCRサイクル終了後4℃で一晩おいたものは電気泳動のバンドに変化はないが、infusion効率が悪い時があった。そのためPCR反応後すぐに精製して用いている。PCR産物末端が削られたせいか？ (4)稀にコロニーが得られないときがあるが、その時はinsert量を3~5倍に増やすと成功することが多い。それでもダメなときは他の方法(bluny-end ligation)を試した方が早い。ただし、insertの質が悪かっただけかもしれない。 (5)ベクターは1-cutだとinsertなしが取れやすいので、stuffer DNA入れて確実に切断できたvector DNAをゲルから切り出し使用すると効果的。アルカリフォスファターゼ処理してもinfusion効率は変わらないようである。最近は制限酵素切断前にPlasmid-Safe酵素処理すると良いかも、思っている。 (6)稀に接続部分が1bp欠けるときがある。 使用経験はないのでコメント出来ませんが、T4 DNA polymeraseを使う方法もあります。 http://www.embl.fr/research/services/berger/ACEMBL.pdf SSBを添加すると効率が向上するようです（論文が出て来なくてすいません） あくまでも私の限定された使用感ですが、ご参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1485-7 - 2013/02/26 (火) 09:58:16 - おお クローニングの効率かの工夫について。 直さにしたベクターの両末端がコンパチブルでなけれはCIAPはいりません。ちゃんと切れていれば電気えいどうできりだせばいいです。電気えいどうしなくても何とかなる裏技もあります。 PCRプロダクトもゲル抽出をするんであれば制限酵素がかんでもそんなに手間が増えるところまでいかないかともおもいます。 例えばベクター側をSmaIなどで切った場合ブラントですが、この場合PCRプロダクトが末端ブラントなので(Taq系でなければ)そのままライゲーションして、ライゲーションプロダクトにSmaIで処理してトランスフォーメーションすればベクターのアルカリフォスファターゼ処理も入りませんしPCRプロダクトの制限酵素や燐酸かなどの処理も入りません。目的の遺伝子にSmaIサイトがないこととベクター側にマルチクローニングサイトいがいに SmaIがないことが条件です。あとPCRプロダクト末端がSmaIサイトをベクターとの結合で作らないことです。

(無題) 削除/引用 No.1485-6 - 2013/02/26 (火) 08:58:07 - aji 私はIn fusionクローニングでうまく行かなかった人なので参考にならないかもしれませんが、印象として、 Ligaseを使う場合に比べて、かなり高濃度のDNAが必要になります。増幅が悪い時や、Low copyのプラスミドだとそこが意外とネックになります。取説から計算してみてもらえると分かります。 また、説明書にもありますがベクターが長いと難しいようです。 困ったことに、欲しいものが取れないときでも結構な数のコロニーが出ます。結局コロニーPCRが必要ならbluntで入れてコロニーPCRで欲しい向きのものを探す方が楽な印象です。

(無題) 削除/引用 No.1485-5 - 2013/02/26 (火) 08:20:16 - びん おおさん、KYさん、早速の御意見をありがとうございます。 どなたかからの、In fusionクローニングについての使用感を引き続きお待ちします。 正確性について次の情報もありました。 Tks Gflex®の正確性 　増幅サイズが約500 bpのとき　0.0131% (42 / 320,204) 　伸長性は別ページでKOD fx neoとの比較あり http://catalog.takara-bio.co.jp/product/tech_info_detail2.asp?unitid=U100006994&masterid=M100005558 KOD plus neoの正確性　正確性はグラフのみの表示 http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/products/product/pcr/archives/2009/10/kod_plus_neo.html 当方の印象としては、増幅成功率を売りにするKODと、それに対向するTks Gflexという感じでしょうか。古くからある両社の健闘を応援したいと思います。 今のところ、次のようにしようと考えています。 増幅は、おおさんの御意見の様に、Tks GflexとPrimeStarとの並行でやってみます。 また既に組み込むべきベクターが決まっていて、既に手元にあるので、TOPOシステムはちょっと使いにくそうです。ベクターへの組み込みは、まず時間優先で、In fusionクローニングで実施してみて、増幅産物はあるけど組み込めなかったという場合には従来法を用いる事にします。 結局、両方を買うという事になると、まんまとタカラバイオさんのビジネス戦略にはまる事になります。

(無題) 削除/引用 No.1485-4 - 2013/02/26 (火) 03:32:32 - おお Tks Gflex DNA polymeraseは使ったことがないですが、わたしならPrimeStarなどと並行して両方で増幅すると思います。 どちらかで増えればOK、両方で増えればノンスペありなし、正確性などを考慮してよい方を優先させるか、両方とも念のために次のステップに持ち込む。 In fusionクローニングについては、この手のやつは随分昔からあるのですが、いまだやったことはありませんので、、、ただ30とかやるのであれば、こういうシステムのほうが効率が上がるとはおもいます(うまくワークすればのはなしですが)。 インビトロジェンのTOPOシステムも細かな作業(制限酵素処理とかCIAP処理とか)省けるのでそっちでもいいかもしれません(こっちはまあまあワークしているようです。といっても回りの人の状況をみるとですが。。1回使ったことはありますがわーくしました)。

(無題) 削除/引用 No.1485-3 - 2013/02/26 (火) 00:39:35 - KY 私だったら、 （１） Tks Gflexで1000bp増やしてクローニングします。PrimeStarだとトータルRNAから1000bp以上になると増えにくいことがあるので、面倒です。Gflex自体はあまり使用したことないのですが、類似品のKOD FX neoで多くのクローニングを行いましたが、PCRのエラーが気になる事はほぼなかったです。2-3クローンシークエンスすれば、大概OKでした。 (2)　In fusionを使用したことないので、的確なコメントできないです。

(無題) 削除/引用 No.1485-2 - 2013/02/25 (月) 19:13:51 - びん 誤字がありました。 初診者ではなく、初心者です。

Tks Gflex DNA polymerase、In fusionクローニング 削除/引用 No.1485-1 - 2013/02/25 (月) 19:11:29 - びん フェノクロ自作の質問でお世話になった者です。久しぶりの世界なので、時代のギャップを感じています。 すみませんが、また２点について御意見を教えてください。 なお、約1000bpを組み込んだプラスミド30種類を作り、HEK293に発現させる必要が生じまして、それに備える知識のアップデートが目的です。 （１）手元には、タカラのTks Gflex DNA polymeraseがあります。ある動物組織から抽出したtotal RNAを材料に予備試験的に300bp程度を作らせるRTPCRをすると、30種類の遺伝子それぞれでよく増幅産物を作ってくれます。タカラの宣伝通りのような感じがしています。 そこでTks Gflex DNA polymeraseで、30種類の約1000bpを作るというのはいかがでしょうか？ それとも、もっと正確性の高いという宣伝のPrimeStarなどで実施すべきでしょうか？ GCリッチ、ATリッチにも強そうなTks Gflex DNA polymeraseに魅力を感じていますが、シーケンスしてみたら不正確だったという事態も避けたいです。 （２）タカラのウェブを見ていて、In fusionクローニングという最近の手法を知りました。これをご使用になられた方の御意見を伺いたいのです。 PCR増幅産物とベクターそれぞれの制限酵素、ベクターのアルカリフォスファターゼ処理、ライゲーションをした後に、大腸菌にトランスフォーメーションするというステップを踏むという方法の方が、コスト的なメリットがありそうです。 一方、挿入したい断片のPCR増幅、ベクターのみの制限酵素、In fusionクローニングキットの反応をした後に、大腸菌にトランスフォーメーションするというステップを踏むという方法の方が、久しぶりにこの手の実験をする者、セカンド初診者には、楽なような気もしています。 実際のところ、どうなのでしょうか？ また他にも何か良い手法がありましたら、教えていただけると有りがたいです。

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