はじめまして。大学院一年の者です。
分子生物学実験で樹木木部細胞より抽出したＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡをもとに、ＤＤ法を行っております。
７Ｍ尿素変性４％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をした後、標的とするバンド部位のゲルを切り出し、それを鋳型としてエタ沈等の精製は介さず直接ＰＣＲを行っているのですが、その際のゲルの扱い方はどうすればよいでしょうか？
様々な実験書をあたってみましたが、統一的な見解が得られず、各々の手順の原理についても詳細な記述がなく困っております。
これまでは
切り出したゲルをエッペンドルフチューブ（1,5ｍｌ)に入れ、超純水50μlで溶かし、一晩室温で放置し、（すぐにＰＣＲを行わなければ４℃保存）、
ＰＣＲの際にはこれを１００℃で１０分、ヒートブロックを用いてボイリングし、数μを採取して鋳型として使う
という手順を用いておりましたが、ＰＣＲの成功率が（特に再度同じサンプルで試行した際に）あまりよくありません。
この中で僕が具体的に疑問である点は二点で
１、切り出したゲルを保存する溶液には何を用いるとよりサンプルにとって安定なのか？ 超純水orTEbuffer？
→超純水であればＤＮＡseが失活されない点が大いに心配です。
ＴＥbufferではＰＣＲの際、ＥＤＴAがポリメラーゼ活性を阻害する事が予想されます。
ＰＣＲへ持ちこむのが５０μ系の反応液（ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ）に対して１μなのでさして影響はないとは思いますが・・・。
２、ゲルからＤＮＡがどのように溶出されるのか？
→室温で放置する理由、ボイリングをする理由は？
室温はＤＮＡにとっては不安定な状態だと思います。一晩という時間の理由も不明です。
ボイリングによってゲルが一時的に溶かされるのは想像がつきますが、その際、１０分もの加熱でＤＮＡが安定であると保証できるでしょうか？
また、これらの作業はＤＮＡ溶液をＴＥbufferにした際には超純水の時と比べて条件を変える必要はあるでしょうか？
ＴＥのpH値が熱を加えることで変わってしまうような気がします。
先述したプロトコルは先代の先生が残してくださったものなのですが、その方と連絡をとることが叶わないため、手順一つ一つの理由を知りえない状況です。
皆さんのお力をお借りしたいです、よろしくお願いします。
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