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イントロンのリボプローブ トピック削除
No.1478-TOPIC - 2013/02/23 (土) 14:05:01 - 初心者１２
リボプローブ合成をしております。

エクソン領域は他のタンパク質とホモロジーが非常に高くプローブ配列に適さないので，同僚がイントロン領域のみからプローブ配列を選択するようにアドバイスしています。イントロンのリボプローブでmRNA前駆体を検出することはできるのでしょうか。ジゴキシゲニンを使用してマウスのin situハイブリダイゼーションをする予定です。
もしエクソンから選択すると100bpのリボプローブになるのですが，短すぎるでしょうか。
何かアドバイスを頂けますでしょうか。
　
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No.1478-6 - 2013/02/24 (日) 17:10:27 - KEN
はっきり見えなかったら、TSA増感を試してみてください。
DIGラベルRNAプローブで可能です。
うまくいくといいですね。

(無題) 削除/引用
No.1478-5 - 2013/02/24 (日) 16:06:33 - 初心者１２
Ken様，Harmonia様，AP様

早速ご回答くださり誠にありがとうございました。

その遺伝子特異的な配列が110bpしかないのでエキソン領域のプローブは１種類しか作れず，まずその部分でプローブを合成しセンス鎖をコントロールとしてin situ hybridizationを行なってみたいと思います。

3.5mM UTP，6.5mM DIG-11-UTPの組成で合成すれば，多少感度は上がるかと思います。

(無題) 削除/引用
No.1478-4 - 2013/02/24 (日) 10:07:02 - AP
100 bpあれば試してみる価値はあります。
標的がどのくらいリッチに発現しているかによりますが、たいていは数百ntオーダーのプローブで十分検出できます。あまり長いリボプローブは伸長しきらなかったり、断片化する必要があるので、あえて最初から100ntくらいの設計にすることもあります。極端な話、合成オリゴをプローブにすることもあるくらいですから。

(無題) 削除/引用
No.1478-3 - 2013/02/23 (土) 17:24:19 - Harmonia
イントロン領域のプローブで、アクティブな転写の検出を目的に実験して
いる方はいます。
イントロン部分のRNAは、スプライシングを受けたあと速やかに分解され
ると想定した実験です。
エクソン領域をプローブにした実験と、観察される結果が異なることが
想像できます。
エクソン領域をプローブにした実験では、ノーザンブロッティングが
傍証になりえますが、イントロン領域をプローブにした実験では、傍証
に何を考えればいいでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1478-2 - 2013/02/23 (土) 17:05:53 - KEN
その遺伝子特異的な繰り返し配列等は、全くない感じでしょうか？
また、発現量によるかとは思います。
リアルタイムPCR等で、確認してみてはどうでしょうか？

というのも、単純計算で、100bpのうち、Uが25塩基。
さらに、その中でDig-UTPになるのは、6.5mM UTP，3.5mM DIG-11-UTPとかの組成で行った場合は、DIG-11-UTPは9塩基程度。

これをどれだけの感度でDetect出来るかでしょうね。
バックがあまり出なければ良いのですが。。。

私なら、増感法を併用すると思います。

PNAプローブやLNA プローブの方が、Detectは行い易いとは思いますが、外れた時が、大きすぎますからね。（笑

プローブは1箇所だけですか？
私なら、もう5箇所くらいプローブを設計し、混ぜて使うと思います。

あと、DNAをDetectしていないことを保証するために、相補鎖のprobeはコントロールで試してみたほうが良いかと思います。

イントロンのリボプローブ 削除/引用
No.1478-1 - 2013/02/23 (土) 14:05:01 - 初心者１２
リボプローブ合成をしております。

エクソン領域は他のタンパク質とホモロジーが非常に高くプローブ配列に適さないので，同僚がイントロン領域のみからプローブ配列を選択するようにアドバイスしています。イントロンのリボプローブでmRNA前駆体を検出することはできるのでしょうか。ジゴキシゲニンを使用してマウスのin situハイブリダイゼーションをする予定です。
もしエクソンから選択すると100bpのリボプローブになるのですが，短すぎるでしょうか。
何かアドバイスを頂けますでしょうか。
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