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(無題) 削除/引用 No.1476-21 - 2013/02/25 (月) 14:12:46 - おお ちょっと当てになるかどうかわからないのですが、お示しのコンディションで電流はどれくらい流れますでしょうか?ゲルの大きさは10cmぐらいのミニゲルでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1476-20 - 2013/02/25 (月) 14:06:16 - おお 膜がふるすぎるとか、、、ウエスタンの経験ではないのですが、ふるいラボにころがっていたナイロンメンブレンでRNAをトランスファーしようとしたら全然だめだったことがあります。 ぬけがきになるならメンブレンのポアサイズを小さくできるならしてもいいかもしれません。 スポンジやろ紙もものによっては目が詰まりすぎていてあまりよくないものもあると思います。スポンジは古いのだとだんだん目が詰まってくるようで、移りが悪くなることはあるようです。わたしとあと知り合いもおそらくスポンジが悪さしているんだろうというようなけいけんがあります。 ただし、サイドバイサイドで確かめたことはないので完全な結論はでてませんが。

マーカーで140ｋＤａまで完全に 削除/引用 No.1476-19 - 2013/02/25 (月) 13:37:20 - Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ マーカーで140ｋＤａまで完全に転写されてゲルに残っていけなければまずＯＫと妥協（？）するべきでしょう。実際、200ｋＤａ近くの分子は一番高い分子量のマーカーバンド（230ｋＤａ）が多少ゲルに残っていてもきちんと抗体がファンクションすれば検出できますよ。

(無題) 削除/引用 No.1476-18 - 2013/02/25 (月) 12:57:16 - TS ちなみにタンクのメーカーは？ SDSを入れた時にマーカーの通り抜けが気になるとのことですが、そのときの転写効率はいかがでしたか。着色マーカーは、製品によって妙に抜けちゃうのもあると思うんです。 転写カセットに入れるときは、転写バッファーで満たしたバット内で行うのが最も一般的かと。

(無題) 削除/引用 No.1476-17 - 2013/02/25 (月) 09:56:26 - ウェスポン 着色マーカーさん ＞なにか、着色マーカーで１００％でほかの一般の低分子で20％の転写効率、というのは私は想像できませんが？　低電流で時間をかけるといいかも？ 　低い電圧で長時間というのはトライしましたが、あまり改善は見られませんでした。私もこんな事態は想定してませんでしたので、気になってトピを立てさせて頂きました。 うさん 　確かにおっしゃる通りなのですが、タンク式で転写率が100％でないことが気になったのでトピを立てさせて頂きました。 　気にするだけ時間の無駄かもしれませんが、やっぱり気になったので… おおさん 　転写バッファーにSDSを入れた時はメタノール濃度を20％に上げて転写時間は1時間にしてやってました。SDSが0.01％でもマーカーの通り抜け（？）が気になりました。記入漏れが多くて申し訳ありません。 　転写をセットするときは濾紙、ゲル、メンブレンをバッファーでひたひたにしてセットしています。あまりよろしくないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1476-16 - 2013/02/24 (日) 23:04:58 - おお >SDSを添加した場合は確かにゲルにはほとんど残っていませんでしたが、マーカーがメンブレンを通り抜けてしまい（色素だけでなくマーカーのタンパクそのものも）、転写後にマーカーを目安にしてメンブレンを切ったりするのでちょっと扱いづらいなと思いました。 SDSを添加した場合はメタノールの濃度をあげる手はあるとおもいます。わたしが見た限り20%のプロとコールがたいがいです。メタノールはタンパクの膜への吸着をそくしんしますが、SDSはその反対のさようがありますから。0.01%ぐらいがよく推奨されています。 えいどうご直接膜にコンタクトして、トランスファーしてますよね?ゲルをバッファーにつけて置換させようとかしてませんよね? >確かにセミドライのバッファーは50mM Tris 39mM Glycine ですね。 セミドライでもこのバッファーは推奨されていますが、セミドライ用のカソードとあノードで違う組成のバッファーもある意味標準的です。あとpH10ぐらいのバッファーも勧められていることがあります。 バイオラッドのタンク式、またセミドライの装置を買うとプロダクトマニュアルがついてきますが、そこにかなりのバッファーバリエーションとうんちくがかかれています。商品を買わなくてもPDFは落とせると思いますので、いちどよまれるといいかもしれません。miliporeもたしかよくまとまったものをもってたかとおもいます。各社読み比べると若干矛盾するところもあるんですが、まあ全体的にはしっていて損はない情報がかかれているとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1476-15 - 2013/02/24 (日) 22:21:56 - う いくらかのタンパク質を泳動したとして、 そのブロッティング方法では転写率が50%だとして、 ある量を使ったら、バンドが出ない、よし、サンプル量を増やそう。 ある量を使ったら、バンドがめちゃくちゃ出る、よし、サンプル量を減らそう。 どんな転写率であれ、これらの作業は全く変わらずやるのではないでしょうか？ つまり、同じ量のサンプルを絶対に使わなければならない だから、転写率をあげるのだ、という実験をするよりも、 サンプルの量を増やす、減らす、のが、早い。

(無題) 削除/引用 No.1476-14 - 2013/02/23 (土) 18:41:37 - 着色マーカー >いちおうウエスタンは問題なく再現性もよくできておりますので、ただの杞憂なのかもしれませんね（苦笑） 基本的にはそういうこと。 >低分子で20％の転写効率はとても低い気がしますが、上のロジックが同様に適用可能かと。 なにか、着色マーカーで１００％でほかの一般の低分子で20％の転写効率、というのは私は想像できませんが？　低電流で時間をかけるといいかも？

(無題) 削除/引用 No.1476-13 - 2013/02/23 (土) 18:03:26 - ウェスポン ＞着色マーカーさんへ追記 　マーカーはどの分子量域でも１００％転写されていますが、転写後のゲルをCBB染色すると結構タンパクが残ってるんですよね…

(無題) 削除/引用 No.1476-12 - 2013/02/23 (土) 17:55:38 - ウェスポン ＞EPCさん 　以前は25mM Tris 192mM Glycine 10%MeOH でやってましたが、バッファーの塩濃度を倍に上げたら同じ電圧でも電流の量が2倍弱になったので、現在の組成で転写してます。 　電流が高くなった分、ゲルへのタンパクの残り具合は現在の方が若干ですが少ないと感じています。ただ、おおさんの指摘もありますし、気のせいかもしれません。 　SDSを添加した場合は確かにゲルにはほとんど残っていませんでしたが、マーカーがメンブレンを通り抜けてしまい（色素だけでなくマーカーのタンパクそのものも）、転写後にマーカーを目安にしてメンブレンを切ったりするのでちょっと扱いづらいなと思いました。 ＞おおさん 　塩濃度が低い方が転写されやすいのですか？確かにセミドライのバッファーは50mM Tris 39mM Glycine ですね。 　ちなみにセミドライ用のバッファーでもトライしましたが、やはりゲルへのタンパクの残りが気になりました。 　泳動を早めに止めるのも考えましたが、やはり分離能が不安でやってません。メンブレンも切りづらくなりますし。 　オーバーナイトの転写も行いましたが、結構ゲルに残ってました。 ＞着色マーカーさん 　 　いちおうウエスタンは問題なく再現性もよくできておりますので、ただの杞憂なのかもしれませんね（苦笑）

(無題) 削除/引用 No.1476-11 - 2013/02/23 (土) 14:37:41 - おお 分解能とか色々あるのでいい方法かどうかわかりませんけど、グラジェントゲルをつかってるんでしたら、若干早めにえいどうをとめると、よりアクリルアミド低濃度のところで止めれるのでトランスファーに有利になるかもしれませんね。特に低分子とか効率が悪いようですし。

(無題) 削除/引用 No.1476-10 - 2013/02/23 (土) 09:48:08 - 着色マーカー >３０〜１００kDaで７０％ 文脈からすると、70％転写されたとも読めますが、１００％である必要はありません。 着色マーカーは私の系（インビトロジェン）では250K−10Kまで１００％転写されます（目視）が、これにも落とし穴があって、着色マーカーは転写されやすい場合があるらしい。 結局、着色マーカーは当てにならない、70％転写され、レーン間でコントロールを取り、データが安定していれば、問題ないと思います。 低分子で20％の転写効率はとても低い気がしますが、上のロジックが同様に適用可能かと。

(無題) 削除/引用 No.1476-9 - 2013/02/22 (金) 23:26:05 - おお ちなみにSDSはトランスファーバッファーにいれてません。

(無題) 削除/引用 No.1476-8 - 2013/02/22 (金) 23:24:40 - おお >[Re:7] EPCさんは書きました : > >[Re:1] ウェスポンさんは書きました : > > バッファー組成は50mM Tris, 384mM Glycine, 10% MeOHです。 > > Towbin　25mM Tris / 192mM Glycine メタノールとSDS　の組成で試してみるのは？　タンク式はTowbinの方が使用者が多いのでは？ > Towbin　25mM Tris / 192mM Glycine メタノール のほうがいっぱんてきですね(組成は思い出せなかったですけど)。イオンが少ないほうが物の移動がたしか早かったはず。短時間のトランスファーではゲルの厚さによっては多少なりとも何か残っているような感覚があります。セミドライでやるばあいはあまり長い時間ながせないので薄いゲルを使うようにしてました(0.75mmとか)。 指摘がありますようにゲルにはえいどうバッファーからのSDSの持ち込みがありますので、あまり関係ないと思います。 わたしはタンク式の場合Towbinのバッファー20%メタノールで25V 16時間(コールドルームで)でトランスファーしています。10%で1.5mmのゲルでも高分子もほとんどがトランスファーされているように思います。

(無題) 削除/引用 No.1476-7 - 2013/02/22 (金) 22:12:49 - EPC >[Re:1] ウェスポンさんは書きました : > バッファー組成は50mM Tris, 384mM Glycine, 10% MeOHです。 Towbin　25mM Tris / 192mM Glycine メタノールとSDS　の組成で試してみるのは？　タンク式はTowbinの方が使用者が多いのでは？

(無題) 削除/引用 No.1476-6 - 2013/02/22 (金) 19:34:39 - ウェスポン ＞うさん ロードした量は１０〜５０ugです。 サンプルの希少性によってまちまちです。 書き漏れが多くて申し訳ないです。 何％残ってるという話ではなくて、「１００％でないのは大丈夫なのか？」という話です。 ちなみに転写後のメンブレンとゲルのCBB染色を比べて、転写された量のだいたいの見た感じでは（定量はしていません）、１００KDa以上では２０〜３０％、３０〜１００kDaで７０％、３０kDa以下では１０〜２０％くらいです。 ５％〜２０％のグラジエントゲルだから低分子領域の効率が悪いのかなって思ってます。 ＞qqさん やっぱり意味はないんですね（苦笑）

(無題) 削除/引用 No.1476-5 - 2013/02/22 (金) 18:58:01 - qq ＞このゲルにはSDSは含まれていないそうなのでSDS入りバッファーで SDSが入っていないゲルであっても、SDS-PAGEをおこなった後であれば、泳動バッファーのSDSがおそらくそのままの濃度（0.1%）でゲル内に浸入しているでしょうから、転写前にゲルを揺する必要はありません。更に、泳動フロントあたりは、サンプルバッファーの濃度のSDSが流れています。 native-pageだと話は別です。

(無題) 削除/引用 No.1476-4 - 2013/02/22 (金) 18:13:24 - う そもそも、 どのくらいの量のタンパク質を泳動しているのかわからないのに、 何％残っているとか、結構残っているとか、 どのくらい転写されたのかとか、 わからないと思うのは私だけでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1476-3 - 2013/02/22 (金) 15:39:38 - ウェスポン 追加の書き込みが多くて申し訳ありません。 ゲルはア○ー社のプレキャストの物を使っております。 このゲルにはSDSは含まれていないそうなのでSDS入りバッファーで転写前にゲルを平衡化（20分）行ってもあまり変化はありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1476-2 - 2013/02/22 (金) 15:36:24 - ウェスポン ちなみにバッファーに0.01% SDSを入れても余り効率は改善されず、SDS濃度を0.1%に上げてみたら今度はマーカーがほとんど通り抜けてしまいました（メンブレンのCBB染色で確認）。

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