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(無題) 削除/引用 No.1476-41 - 2013/03/04 (月) 16:42:10 - み >[Re:40] ウェスポンさんは書きました : > みさん > > > MeOH濃度って普通20%じゃないですか？ > > > てっきりMeOH濃度下げた方がゲルからのタンパクの抜けが良くなると思ってましたが、違うんですかね？ > 最初はMeOHは20％でやってましたが、個人的には20％MeOHの方がタンパクがゲルに残ってる気がしました。 そうですか　問題解決には繋がらなそうですね　残念

(無題) 削除/引用 No.1476-40 - 2013/03/04 (月) 14:44:22 - ウェスポン みさん > MeOH濃度って普通20%じゃないですか？ > > 以前のラボでは僕も10%でやっててその時は確かにゲルに残存する蛋白が気になった。 > ラボを移って20%でやったら残存はなくなった（ただし、ラボ移動によりトランスファー機器も両者で異なるから濃度だけの問題じゃないかもしれんけど・・・） てっきりMeOH濃度下げた方がゲルからのタンパクの抜けが良くなると思ってましたが、違うんですかね？ 最初はMeOHは20％でやってましたが、個人的には20％MeOHの方がタンパクがゲルに残ってる気がしました。 特に低電圧オーバーナイトで転写するとマーカーすらゲルに残ってたりしました。 そんなことがあったので、現在は10％の濃度に落として転写してます。

(無題) 削除/引用 No.1476-39 - 2013/03/04 (月) 12:16:30 - み MeOH濃度って普通20%じゃないですか？ 以前のラボでは僕も10%でやっててその時は確かにゲルに残存する蛋白が気になった。 ラボを移って20%でやったら残存はなくなった（ただし、ラボ移動によりトランスファー機器も両者で異なるから濃度だけの問題じゃないかもしれんけど・・・）

(無題) 削除/引用 No.1476-38 - 2013/03/04 (月) 09:53:19 - ウェスポン 12345さん > 10μg/lane 適正な量とおもいます。私たちもほぼそのくらいでやってます。 それでもやっぱり残ってしまうので、タンパク量の問題ではないと思うのですが…

(無題) 削除/引用 No.1476-37 - 2013/03/03 (日) 00:44:31 - 12345 10μg/lane 適正な量とおもいます。私たちもほぼそのくらいでやってます。

(無題) 削除/引用 No.1476-36 - 2013/03/02 (土) 08:49:37 - ウェスポン １２３４５さん > 泳動した蛋白質量が多い（というか多すぎだと）と、移りきらない分はゲルに残る。単位面積あたりの膜に結合出来る蛋白質量もやっぱ限度あるし。 メンブレンがPVDFでレーンあたり10ugってのは多過ぎでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1476-35 - 2013/03/01 (金) 02:27:01 - １２３４５ 泳動した蛋白質量が多い（というか多すぎだと）と、移りきらない分はゲルに残る。単位面積あたりの膜に結合出来る蛋白質量もやっぱ限度あるし。

(無題) 削除/引用 No.1476-34 - 2013/02/26 (火) 16:41:18 - ウェスポン TSさん > 抜けにくいマーカーを見つけて、0.1％SDSで流す、という戦術は？ > いろいろなメーカーが少量の試供品を配布しているので。 > > わたしは、Bioradのマーカーを使っていて、やはりマーカーの見え方が少し薄いなぁと常々思っていましたが、先日、和光純薬のマーカーの試供品を試したら、ずいぶんきれいにメンブレンに残っていました。和光の方が安いし、次は和光のを買おうと思っています。 ラボにもう1種類プロテインマーカーがあるので、そっちも試してみたいと思います。和光さんのも検討してみます。ありがとうございました。 おおさん > しかしマーカーのためにわざわざ、サンプルの転写効率を下げないといけないのも、、、本末転倒というか、、、別に質問者さんを攻めるわけではないですが、、、 本当ですね（苦笑） 色々とまた試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1476-33 - 2013/02/26 (火) 13:07:59 - おお しかしマーカーのためにわざわざ、サンプルの転写効率を下げないといけないのも、、、本末転倒というか、、、別に質問者さんを攻めるわけではないですが、、、

(無題) 削除/引用 No.1476-32 - 2013/02/26 (火) 12:20:14 - TS そうでしたか。 そうすると、サンプルのタンパク質が良く転写される条件とお使いのマーカーが良く見える条件を揃えるのは難しいかもしれません。 抜けにくいマーカーを見つけて、0.1％SDSで流す、という戦術は？ いろいろなメーカーが少量の試供品を配布しているので。 わたしは、Bioradのマーカーを使っていて、やはりマーカーの見え方が少し薄いなぁと常々思っていましたが、先日、和光純薬のマーカーの試供品を試したら、ずいぶんきれいにメンブレンに残っていました。和光の方が安いし、次は和光のを買おうと思っています。

(無題) 削除/引用 No.1476-31 - 2013/02/26 (火) 11:26:06 - ウェスポン TSさん > 0％SDSだと転写効率に満足できず、0.01％だと少し強烈すぎる。 > 中間濃度を試さないのですか? > お好みの条件がすぐに見つかりそうですが。 0.1%だとマーカーが抜け過ぎて、0.01%だとマーカーが少し抜けて見づらくなって且つゲルのタンパクの残りがかなりありました。 なのでSDS入り転写バッファーはちょっと扱いづらいなあと思ってました。 説明不足でした。申し訳ありません。 > マーカーが抜けやすいようなら、マーカーのローディング量を増やせば済むかも。 そうかもしれません。試してみます。

(無題) 削除/引用 No.1476-30 - 2013/02/26 (火) 10:51:35 - TS 0％SDSだと転写効率に満足できず、0.01％だと少し強烈すぎる。 中間濃度を試さないのですか? お好みの条件がすぐに見つかりそうですが。 マーカーが抜けやすいようなら、マーカーのローディング量を増やせば済むかも。

(無題) 削除/引用 No.1476-29 - 2013/02/26 (火) 10:04:28 - とおりすがり タンパク質毎に転写され易い難いがあるしサンプル中の量も違うから目的のタンパク質の転写効率を上げるしかないよね 100％転写は無理だしそこを目指して労力を費やす実験系でないというのは皆さんの共通認識だと思います 個人的には下の転写効率の確認方法が疑問 >[Re:6] ウェスポンさんは書きました : > ちなみに転写後のメンブレンとゲルのCBB染色を比べて、転写された量のだいたいの見た感じでは（定量はしていません）、１００KDa以上では２０〜３０％、３０〜１００kDaで７０％、３０kDa以下では１０〜２０％くらいです。 ゲル2枚を同時に流して転写前と転写後をCBB染色で比較したことはありますが、この方法でも大まかに確認できますか？

(無題) 削除/引用 No.1476-28 - 2013/02/26 (火) 09:43:12 - ウェスポン おおさん > 電極からでている白金線が切れているとかないですよね。。。 さすがにそれはないです（苦笑）

(無題) 削除/引用 No.1476-27 - 2013/02/26 (火) 03:02:48 - おお ちょっと失礼な質問かもしれませんが、、 電極からでている白金線が切れているとかないですよね。。。

(無題) 削除/引用 No.1476-26 - 2013/02/25 (月) 19:21:22 - ウェスポン >[Re:25] おおさんは書きました : > > そんなに極端にへんではないですね。イオン強度が倍とかんがえると。 なのに転写効率があまり良くないので気になってます。 タンク式でも転写効率は100%でないんだとして何も考えずにやるのがいいのかもしれません。 > すっかすかなのでスポンジはバッファーにつけずにはさんでます。そのごえいどうそうにほりこむと、すかすかの空間にバッファーがフィルされているようで、それでうまくいっています。 > そうなんですね。空気だらけで気持ち悪いと思ってました（苦笑）

(無題) 削除/引用 No.1476-25 - 2013/02/25 (月) 17:08:48 - おお >[Re:24] ウェスポンさんは書きました : > おおさん > > ゲルの大きさは8x8センチくらいのミニゲルです。 > 電流量は、100V 2時間で始めは450mAくらいで終わるころは650mAくらいです。 そんなに極端にへんではないですね。イオン強度が倍とかんがえると。 > すっかすかのスポンジの奴は以前共同研究先でいちど使ったことがありますが、バッファーがなかなかスポンジに染み込まずに困りました（苦笑） > スポンジ内は空気だらけでしたが、その時の転写自体は上手く行ったようでしたけど。 すっかすかなのでスポンジはバッファーにつけずにはさんでます。そのごえいどうそうにほりこむと、すかすかの空間にバッファーがフィルされているようで、それでうまくいっています。

(無題) 削除/引用 No.1476-24 - 2013/02/25 (月) 16:28:08 - ウェスポン おおさん ゲルの大きさは8x8センチくらいのミニゲルです。 電流量は、100V 2時間で始めは450mAくらいで終わるころは650mAくらいです。 すっかすかのスポンジの奴は以前共同研究先でいちど使ったことがありますが、バッファーがなかなかスポンジに染み込まずに困りました（苦笑） スポンジ内は空気だらけでしたが、その時の転写自体は上手く行ったようでしたけど。

(無題) 削除/引用 No.1476-23 - 2013/02/25 (月) 16:10:45 - おお バイオラッドのスポンジはいまポリウレタンフォームにかわってすっかっすかで向こうが見えるぐらい大きな目になっています。これだと全く抵抗がなさそうに思えます。確かそんなに高くなかったような記憶があるので、この際買い替えてみてはどうでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1476-22 - 2013/02/25 (月) 14:48:02 - ウェスポン TSさん トランスファーの機械はBioradの以下のものの古いバージョンです。 http://www.bio-rad.com/prd/ja/JP/LSR/PDP/589ca8f7-5751-487a-a453-571ee8cc8b7e/%E3%83%9F%E3%83%8B%E3%83%88%E3%83%A9%E3%83%B3%E3%82%B9%E3%83%96%E3%83%AD%E3%83%83%E3%83%88-%E3%82%BB%E3%83%AB この時のゲルへのタンパクの残りはほとんどありませんでした。 ただ前の回答にも書いた通り、マーカーが見えないと扱いづらいなと思いました。 プロテインマーカーはCSTのもの(http://www.cstj.co.jp/products/7720.html)を使っています。 セミドライのときはメンブレンとゲルの間に余計なバッファーがあるとよろしくないようですが、実際どうなんでしょうね？ セミドライの機械では転写ムラで困ったことはありましたが、タンクでは今のところ大丈夫そうです。 In vitroさん ＞マーカーで140ｋＤａまで完全に転写されてゲルに残っていけなければまずＯＫと妥協（？）するべきでしょう。実際、200ｋＤａ近くの分子は一番高い分子量のマーカーバンド（230ｋＤａ）が多少ゲルに残っていてもきちんと抗体がファンクションすれば検出できますよ。 やっぱりそうかもしれませんね（苦笑） ウエスタンで高分子量域も問題なく検出できております。 今まではタンクの転写効率は100％近いと勝手に思い込んでいたので、ちょっと気になってしまったのですよ。 色々といい勉強になりました。 おおさん 最近使ってるメンブレンは新品です。 ポアサイズは今のは0.45umなので、小さいものも費用対効果も含めて検討してみます。 スポンジはかなり古いですね。 一応使用後のケアなどは丁寧にやっているつもりです。 色々と考察できることがありそうですね。 ありがとうございました。

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