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(無題) 削除/引用 No.1460-9 - 2013/02/24 (日) 12:08:27 - おお 割り算せずに引き算か、相対発現量にすればいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.1460-8 - 2013/02/24 (日) 11:34:46 - 初心者 返信ありがとうございます。 コントロール区の発現量が低いのです。 処理区では20前半サイクルまで上がりますので。 ノーマライズするとぶれが大きくなってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.1460-7 - 2013/02/24 (日) 06:29:35 - おお >[Re:5] 初心者さんは書きました : > 原因はどうやら標的遺伝子の発現量が低すぎることにあるようです。 > 35サイクルだったり、36サイクルだったりするため、 > 毎回データが変わってしまうようです。 > プライマーを設計し直しても変わらないとは思うのですが..... 発現しているポジこんはないの?

(無題) 削除/引用 No.1460-6 - 2013/02/23 (土) 16:37:53 - KEN 釈迦に説法かもしれませんが、TaqMan Probe法で行っていますか？ SYBR法ならば、実はRNA抽出に失敗して何も増えていなくて、ただのプライマーダイマーじゃないかと思います。 以前、とある細胞へ検体を変更したとき、RNAの収量が下がり、Qiagenの抽出キットを変更し対応したことがあります。 RNAのサンプル自体は、大丈夫でしょうか？ まずは、cDNAの添加量を増やすか、プライマー設計の変更、Life TechnologiesのTaqMan PreAmp Poolsみたいな感じで前増幅させるかでしょうかね。 ただ、TaqMan PreAmp Poolsにしても「0.3 ng/μLのサンプルcDNAを使用した際に、35サイクル以下で増幅してくるアッセイを使用すること」という但し書きがありますので、今回の実験系では、厳しいかもしれませんが。。。

(無題) 削除/引用 No.1460-5 - 2013/02/23 (土) 12:51:33 - 初心者 原因はどうやら標的遺伝子の発現量が低すぎることにあるようです。 35サイクルだったり、36サイクルだったりするため、 毎回データが変わってしまうようです。 プライマーを設計し直しても変わらないとは思うのですが.....

(無題) 削除/引用 No.1460-4 - 2013/02/21 (木) 20:01:33 - alpha RNA量は少なくても、安定しますよ？ 私もその程度のRNA量ですが、困ったことはありません。 qpさんの仰るようにテクニックの上達が先じゃないですかね？

(無題) 削除/引用 No.1460-3 - 2013/02/21 (木) 09:13:49 - qp テクニックの向上のための努力ってのはどうでしょうか？ 経験からくるうんちくを聞くだけで素人が上達することは無いと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.1460-2 - 2013/02/20 (水) 09:55:20 - AP データが安定しないとは、具体的にどういう状態なのですか？ 1) 同じcDNAを使っても、増幅曲線が大きく異なる。 2) 同じスキームで作製した異なるロットのcDNAで、増幅に再現性がない。 3) いずれにしても、内部標準で補正しても、再現性がとれないのかどうか。 2であれば、逆転写効率がサンプル毎に大きく異なるのは普通なので、ある程度、仕方がないと思いますが。

逆転写時のRNA量とPCRデータのぶれ 削除/引用 No.1460-1 - 2013/02/19 (火) 17:24:21 - 初心者 現在real time PCRをやっているのですが、 細胞から逆転写するときのRNA量が少ないせいか、(〜100ng) データが安定しません。 同じプライマーで、組織からやったときは安定していたのですが。 RNA量を例えば、300ng、500ngと増やしていけば、 データも安定していくでしょうか？ 皆様のご経験談を伺いたいです。

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