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(無題) 削除/引用 No.1429-5 - 2013/02/11 (月) 12:15:32 - 匿名 「低速遠心後の上清がきれい」である必要は無いと思います。上清にはnon-parenchymal cellが存在しているので、1-2回目の低速遠心では上清は当然濁っています。 私は50rcf、1分、4℃を3-4回行っています。上清を取るときはペレットまで一定の距離を確保します。ぎりぎりまで攻める必要は無いです。あと、最後の遠心は450rpmではなく450rcfです。

(無題) 削除/引用 No.1429-4 - 2013/02/11 (月) 03:46:02 - おお >[Re:3] 肝ぞうさんは書きました : > 低速遠心は50g 5分でよかったでしょうか？ > 上清を取るとき、底にたまったどろっとした部分は > できるだけとらないようにした方がいいのでしょうか？ > どろっとした部分に表面あたらいは白血球がいるような気がして、 > 捨てるべきが、少し吸うべきか、悩んでいます。 > そこの部分は別にとって調べてみれば良いじゃないですか?

(無題) 削除/引用 No.1429-3 - 2013/02/11 (月) 03:32:36 - 肝ぞう 匿名様、ご回答有り難うございます。 目的はFACSです。 3,4回低速遠心によりもっと綺麗な上清がとれるということ、 試してみたいと思います。 低速遠心は50g 5分でよかったでしょうか？ 上清を取るとき、底にたまったどろっとした部分は できるだけとらないようにした方がいいのでしょうか？ どろっとした部分に表面あたらいは白血球がいるような気がして、 捨てるべきが、少し吸うべきか、悩んでいます。 また上清プール後の450rpm（＝50gくらい？）も低速のように思いますが、 これで充分に白血球ペレットができますか？

(無題) 削除/引用 No.1429-2 - 2013/02/09 (土) 09:39:26 - 匿名 FACSをするということでしょうか？ 私は低速遠心3-4回の上清をプールしたあと、450rcfで5分遠心してペレットを作り、FcgRブロックの後FACSにかけてCD45+をleukocyteマーカーとして分離しています。 肝細胞や死細胞はFSC/SSCである程度除外できますし、FACSならKupfferやmonocyte, neutrophilもついでに分離できるので便利です。

マウス肝よりleukocyteを採取したい 削除/引用 No.1429-1 - 2013/02/09 (土) 02:44:29 - 肝ぞう マウス肝をperfusion後、採取してmesh上で細切、 コラゲナーゼ/DNAse液中で10分振盪により肝内細胞を採取しました。 ここで50g 5分遠心によりhepatocyteとnon parenchymal cellを 分取しようと試みましたが、遠心後の上精は濁っており 死んだhepatocyteと思われるゴミも多数浮いております。 もっとpureなnon parencymal cellを採取したいのですが、 percoll等を用いたprotocolも諸説あり どの方法がいいのかわからなくて困っております。 mono nuclear cellの採取ではなく、全leukocyteを hepatocyteから分取する最適な方法をご存じの方がおられましたら ご教授頂けませんでしょうか

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