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(無題) 削除/引用 No.1416-7 - 2013/02/06 (水) 19:43:37 - おお >[Re:4] nattoさんは書きました : ありがとうございました。どのくらい壊れているかという認識を持つことがだいじなようですが、方法を紹介しているような文献ではあまりちゃんとかかれてないのが現状みたいですね。。。 確かにまんまるの培養細胞からとるとき、ぷちぷち切れたものが取れているんだろうなぁとおもえるのですが、そう考えるとなるべくインタクトなものをとろうとしているということを考えると、どうも考えているうちに矛盾スパイラルに陥ってしまうのです。。。 具体的なアドバイスもありがとうございました。ちょっと細かくきいてみたいこともありそうなのですが、時間が余りないので、、、

(無題) 削除/引用 No.1416-6 - 2013/02/06 (水) 19:36:07 - おお >[Re:3] 脂肪さんは書きました : > ミトコンドリア分画前の細胞破砕の段階でフリーズソーさせるってプロトコールを見たことがあります。（ソース失念） > 複合体各々（COX以外）の酵素活性測定であれば、凍結サンプルでも可能かと思いますが。 ありがとうございました。動物組織なんか凍結したものからでもいいと書いたものもありますよね。ATP合成をみるものは精製後だめってかかれてたような気がします。COXなどの活性は凍結して保存したミトコンドリアでもいいとかかれているプロとコールは多いような気がするんですが。。。

(無題) 削除/引用 No.1416-5 - 2013/02/06 (水) 15:39:06 - abc 壊れたミトコンドリアが1割くらい含まれていたとして、 活性測定では 完全にインタクト：実際の測定＝1:0.9 で測定誤差範囲内だけど、 プロテアーゼを使ったりする実験だと 完全にインタクト：実際の測定＝0:0.1 で分解されたものがポジティブな結果だと解釈してしまう なんてことで条件の厳しさが違うって可能性がある？？

(無題) 削除/引用 No.1416-4 - 2013/02/06 (水) 10:53:09 - natto 間違えてEnter押してしまいました、すみません。 ミトコンドリアでインタクトというとかなりシビアな意味で使われます。膜電位に関する研究が盛んだった時期があるため、プロトンがリークするミトコンドリアはインタクトとは言えません。そのような背景があるので以前は膜電位とは関係ない実験であっても同程度の質が要求されたと思います。 ただ、これは質の高いミトコンドリアを調製しやすいモデル的な材料の場合であって、培養細胞で特にフュージョンしたミトコンドリアが多数みられるものではそもそもほぼインタクトなミトコンドリアを調製出来ないと思いますので、強くは拘らないようになってきていると思います。 ミトコンドリア調製するときに遠心チューブは氷に挿して冷やすと思いますが、結露は取り除いてから使っているでしょうか。結露＝低張液なのである程度の量のミトコンドリアが簡単に破裂します。そのようなサンプルでインタクトであるかどうかを議論する意味もありませんし、知らずに調製している人はそれなりの数が居ると思うので、他人の話を鵜呑みに出来ないでしょう。 ちなみにラット肝やウシ心筋から調製したミトコンドリアでは液体窒素で凍結したサンプルを溶かしてもNADHはまだ膜をよくは透過しません。NADHが通れるほど膜を壊すには-８０度での凍結が有効です。シトクロムCが抜けるには最低限その程度の破壊が必要だと思います。あくまで最初の調製時に膜が壊れていない前提です。

(無題) 削除/引用 No.1416-3 - 2013/02/06 (水) 10:51:05 - 脂肪 ミトコンドリア分画前の細胞破砕の段階でフリーズソーさせるってプロトコールを見たことがあります。（ソース失念） 複合体各々（COX以外）の酵素活性測定であれば、凍結サンプルでも可能かと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1416-2 - 2013/02/06 (水) 10:38:44 - natto ミトコンドリア

精製したミトコンドリア 削除/引用 No.1416-1 - 2013/02/06 (水) 06:45:09 - おお 精製したミトコンドリアを凍結しで後日使う場合どういう支障があるでしょうか? いろいろ見ているのですがどうもあまりはっきりしたことがつかめません。呼吸さ酵素かっせいなどは凍結して後日というのは結構やられているようですが、膜タンパクのトポロジー(プロテアーゼを使ったりする実験)に関しては凍結するなとかかれています。 プロテアーゼが入り込むようであればやはりインタクトとはいえないとも思いますが、呼吸さとか cytochrome Cとか使っていますし、それが出てくるようなら従来の活性をはんえいしてないでしょうし、、、 cytochrome Cは凍結すると漏れてきたというようなご経験とかどなたかいらっしゃいますでしょうか?また経験の豊富なかたの意見が聞けたらたいへんうれしく思います。

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