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(無題) 削除/引用 No.1412-9 - 2013/02/05 (火) 11:15:12 - 中年 ミニプレップだと取れるのにラージスケールで培養するとプラスミドの収量が落ちるというのは、このフォーラムでお馴染みのトピックです。 アンピシリン耐性遺伝子産物のβ-ラクタマーゼは菌体外酵素なので、培養が少し濁りだした程度のタイミングで培地中のアンピシリンは枯渇しています。大腸菌の生育に影響のないプラスミドの場合は、選択が失われてもプラスミド保持菌が順調に増えるので問題ありませんが、生育に悪さをするプラスミドだと、この後はプラスミドを失った菌が保持菌の増殖を凌いでしまうことがあります。 もし、ラージスケールの種菌としてオーバーナイトカルチャーを培地ごと使っているなら、それを止めてコロニーからスタートすると解決するかもしれません（問題が軽度の場合）。培養の途中で菌体を遠心で回収し、一度培地で洗浄した後に再度アンピシリン入りの培地に再懸濁して培養を続けることが有効な場合もあります。不幸なことに大腸菌に酷く嫌われているプラスミドの場合は、コピー数を落とす目的で培養温度を30℃に下げ、収量の低下は培養スケールで稼いでください。

(無題) 削除/引用 No.1412-8 - 2013/02/05 (火) 10:09:49 - hotto みなさん 私の稚拙な質問に応えてくださり、ありがとうございます。 なるほど、色んな考えがある中、結構やられてる方もいらっしゃって驚いています。 レンジでLB plateを作製する際、一瞬の沸騰でも充分に均一な溶液が作られるようですし、本当に時間が無い時には実践したいと思います。 また、芽胞形成菌については確かに難しいですね。 私はDH5αやTOP10大腸菌の形質転換に使用するだけですので、これらの増殖能が早ければさほど問題にはならないようですね。ただ、長期間使用しないようなplateは注意が必要とのこと合点しました。 今後、原則オートクレーブで行おうと思いますし、そうなった経緯もアットザベンチで調べようと思います。 最近、形質転換時にサテライトがやけに多いように感じ、その中で12個くらいpickして2ml の液体培養後にprepすると確かに入ってるのですが、それを100 ml液体培養に移すと増えなくなるとかが続いており、なんなんだろう。。と頸を傾げています。今後調査していきます。 ありがとうございます。

裏技のようなもの 削除/引用 No.1412-7 - 2013/02/05 (火) 09:37:29 - z Agar plate上で何かデータを取得する訳では無く、単に目的のプラスミドが取れればよいということであれば、オートクレーブの手間を省ける良い裏技？のようなものだと思います。 私もよく電子レンジ加熱のagar plateを使いますが、忘れて冷蔵庫に数ヶ月置いてもカビがはえることもほとんどありません。 サテライトも特に出やすいこともありませんし、オートクレーブのものと遜色ないですよ。 オートクレーブをしないとちゃんとしたプラスミドが取れないとか科学的に説明されるものがあればやりませんが、原理や物性などをよく理解している研究者であれば実験書通りとか指導に従ってとかに留まらず頭を使って工夫したりトラブルに対処したりするでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1412-6 - 2013/02/05 (火) 09:25:09 - ~ 使用する器具に重篤な汚染がなければ、教えた人の想定している使用範囲内であれば問題がないのでしょう。 その範囲を超えた場合には望ましい実験結果が得られなかったり、周りに迷惑がかかる場合があり得ますので気を付けましょう。そのような状況を引き起こすと、”怖い方”に怒られるかもしれません。 >きっと良くないのでオートクレーブなんだとも思います。 その考えまで至ったのであれば、オートクレーブでどのような処理が行われているかまで調べてはいかがでしょうか。 そうすれば、なぜオートクレーブが使われるかが分かるでしょうし、”怖い方”になぜ自分だけがオートクレーブ処理したLBプレートを使用するかの説明ができるようになるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1412-5 - 2013/02/05 (火) 06:08:50 - おお 滅菌がパーフェクトでないというのは何かの都合で長期保存しないといけないとかいうばあい何かはえるかのうせいが高いとおもいます。 シュガーがはいったものだと余計にひどいかもしれませんね。 わたしが電子レンジを使う場合はたいてい、その時の実験に必要なぶんだけです。

(無題) 削除/引用 No.1412-4 - 2013/02/05 (火) 00:55:05 - おお えっとついかしますと、どこかの商品で電子レンジで作成できるLBなどのmixを売って多様な気がします。 わたしもたまに、レンジですますことはあります。 しかしながら滅菌としてはパーフェクトではないです。

(無題) 削除/引用 No.1412-3 - 2013/02/05 (火) 00:50:48 - おお 目的の大腸菌はそれでも増えると思います。 ファージの滅菌にそれで十分かはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.1412-2 - 2013/02/04 (月) 23:28:15 - 直輝 レンジでチンは滅菌方法としては不十分でしょう。 でも、一晩37℃でおくだけなら大腸菌の方が生育速度が速いから、実際には問題にならないんでしょうね。 室温で３日ぐらい置いてたらカビが生えてくるかも（笑） Ampはちゃんと入っているから、サテライトが出やすいってことはないと思います。 うっかりプレートを切らしたって時に便利そうなやり方ですねｗ

LB plateはオートクレーブ滅菌？レンジでチン？ 削除/引用 No.1412-1 - 2013/02/04 (月) 22:39:00 - hotto 稚拙な質問で恐縮しておりますが、一つご意見伺わせてください。 私は大腸菌プレートの作製時にはLBブロスとagarを秤量し、三角フラスコに入れ、milliQ水を入れた後、アルミでフタをしてオートクレーブ滅菌すると習いました。（121°C, 20 min） しかし、私のラボの方はオートクレーブではなく、レンジで加熱し、一瞬の煮沸を確認して、それを冷やした後、Ampを加えてplateに注いでいます。 これで問題はないのでしょうか？ 怖い方で聞くのが躊躇われております…もしこれでも問題ないのならそれにならいたいのですが、 きっと良くないのでオートクレーブなんだとも思います。 このプレートを使うとサテライトコロニーが出やすいとか、変なコロニー出来やすいとかみなさんのご意見聞かせてください。

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