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(無題) 削除/引用 No.1400-7 - 2013/01/31 (木) 18:17:54 - MH KENさん 回答ありがとうございます。 うっすらバンドが出たサンプルは、どうせシーケンシングできないと思って捨ててしまいました・・・2ndPCRというのは思い付きませんでした。勉強不足でお恥ずかしいです・・・ コンタミの可能性ですが、一度にそれほど多くのサンプルを扱っているわけではないですし、気を付けてはいるつもりですが、知識の足りない未熟者なのであり得なくはないと思います。いつもPCは用意していますが、NCは用意したことがありませんでした。これからはNCも用意することにします。

(無題) 削除/引用 No.1400-6 - 2013/01/31 (木) 16:42:49 - KEN sequenceに失敗したとのことですが、うっすらバンドが見える失敗したPCR産物は残っていますか？ もし残っているならば、それらを用いて同じプライマーで2nd PCRを行い再度、シークエンスするというのも一つの手です。 (PCRによるエラーが増えるとか言われるかたもいらっしゃるかもですが、よっぽどダメな酵素を使わなければそう問題にならないかと) アニーリング温度をいじれば、なんとか行くと思いますが、私は、sequence解析の時は、2セットの違うプライマーで一つの領域をカバーできるようにすることが多いです。一つのプライマーが駄目でも、もう一つのプライマーでPCRならびにsequenceがかかればよいわけですから。 案外、Del.とかで走んなかったりすることはありますからね。 >過去に一回バンドが出ているので あと、案外大量検体を扱っているときに多いのが、コンタミ。 以前、一日に数百検体のPCRを行っていたことがありますが、やったーきれいに出たーと思っていたらなぜかネガコンを含め96well全てが増えていたり、sequenceした後で、全検体に同じMutationが入っていておかしいなあと思って実験し直したらコンタミだったなんてこともありました。(笑 sequenceでも常に、ネガコン(DW)もPCRの時は一緒に行うことをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.1400-5 - 2013/01/31 (木) 15:35:20 - ＭＨ さっそく返信ありがとうございます。 テンプレートは、種及び血清型が同じ株を用いています。プライマーセットは共通(1種類のFとR)で、Taq,buffer,ｄNTP,プライマー,PCR用滅菌水を全て混ぜたものをPCR用のチューブに分注し、その後それぞれのチューブに別のテンプレートを加えて機械にかけています。その後電気泳動を行った結果、1レーン(問題のテンプレートのレーン)だけ泳動でバンドが出ませんでした。 アニーリング温度はまだいじっておりませんので、下げてもう一度PCRしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1400-4 - 2013/01/31 (木) 14:42:20 - AP 種の違うゲノムDNAたちを、共通のプライマーセットたちでPCRをかけたら、ある一種のDNA、ある一組のプライマーセットの組合せだけ、PCRがかからなかったということでしょうか。 その種だけ、プライマーの部分の配列がdiverseしているとか？ それだとしても、アニール温度をいじってやればなんとかできそうな。

(無題) 削除/引用 No.1400-3 - 2013/01/31 (木) 14:35:49 - AP さきほど、質問の内容を読み違えてコメントしましたので、削除してコメントします。 PCRがうまくかからないなら、サーマルサイクルの条件（アニーリング温度を下げるなど）をいじったらいいだけではないですか？　前回と同じ条件（前回たまたま上手くいったとしても）、ほかのサンプル・プライマー（おそらくTmなども異なる）と同じ条件にこだわる必要はないし、違ってあたりまえと思いますが。

PCRの失敗 削除/引用 No.1400-1 - 2013/01/31 (木) 14:02:57 - ＭＨ 同じ種類の細菌複数株からDNAを抽出し、PCR⇒シーケンシングにかけるという作業を行っています。 一回全ての株のPCRを終了し、シーケンシングにかけたのですが、うまく結果が出ず、その原因を探るために再度PCRからやり直すことになりました。 前回と全く同じ試薬、テンプレート量及び機械の設定でPCRし、電気泳動を行ったのですが、ある1つのテンプレートのみ、バンドが出ませんでした。 ラダーや他のテンプレートの結果は非常にきれいなバンドが出たため、泳動の失敗、機械、プライマー及びPCRの試薬が原因ではないと思います。過去に一回バンドが出ているので、機械の設定も間違っていないと思います。 テンプレートが薄すぎる、または濃すぎる可能性を考え、いつもは5µl入れるところを、10µl、及び3µlで試してみたのですが、10µlでは非常に薄いバンドが、3µlでは全く何も出ませんでした。この結果から、テンプレートが薄すぎる可能性が高いかと思われたのですが、他のプライマーで同じテンプレートのPCRを行ったところ、きれいなバンドを得ることができました(プライマー以外の条件は、試薬、テンプレート量や機械の温度設定など全て同じです。) つまり、バンドが出なくなる(または非常に薄くなる)のはそのプライマーとテンプレートの組み合わせでPCRしたときだけなのです。 このPCRの失敗の原因は一体何だと考えられるでしょうか。 読みづらいところ、わかりにくいところあるかと思います。質問には何でもお答えしますので、どうかご教授お願いいたします。

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