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(無題) 削除/引用 No.1385-6 - 2013/01/29 (火) 03:00:24 - KEN どのような方法でサブクローニングしたかにもよると思いますが、導入前のPCRで用いたプライマーの配列が残っているならば、それを用いて両側からシークエンスしても多くの場合読めます。 もっとも、ベクター内にT7とか入れて設計しているならば、それを用いた方が無難かとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1385-5 - 2013/01/28 (月) 16:18:34 - AP シークエンス用プライマーが18merとかふつうじゃないですか。 M13系のいわゆるuniversal primerの類はみんなそんなもんでしょう？ BigDye付属のコントロールプライマー（–21 M13 primer）も18mer TGTAAAACGACGGCCAGTですよ。 念のためいうと、Tmというのは全相補DNA対のうち50 %が水素結合で対合する温度です。BigDyeのサイクルシークエンスの最低温は50℃がデフォルトですが、Tmが50℃以下のプライマーは全くアニールしないという訳ではないです。

(無題) 削除/引用 No.1385-3 - 2013/01/28 (月) 15:50:39 - おお もし不安ならそのプライまーとベクターにある配列(t7プロモーターとか)でpcrしてみてうまくかかるかみてみればいいかと思います。何の細工もなくうまくかかるようであれば、シーケンスもうまくいく可能性は高いかと。

(無題) 削除/引用 No.1385-2 - 2013/01/28 (月) 15:47:43 - おお たとえばベクターないによくある(お示しのプラスミドは確認してみないと思い出せませんが)T7やM13などのプライマーは20マー前後でTmは50度より低いですが、それを使ってよくベクターからシーケンスをかけることはよくあります。非常にきれいに配列が読めるプライマーだったりします。 T7 promoter: TAATACGACTCACTATAGGG The basic Tm is 48 °C The salt-adjusted Tm is 43 °C The base-stacking calculated Tm is 47 °C http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm

シーケンス用プライマーの設計法について 削除/引用 No.1385-1 - 2013/01/28 (月) 15:33:27 - daityoukin pGEX-4T-2ベクターにサブクローニングしたDNAをシーケンスによって配列確認をしようと思います。 ところが困ったことに研究室にあるプライマーはTm値50℃あるかTm値が低いプライマーを使ってシーケンスをうまくかける方法はあるのでしょうか？ プライマーの長さは18merで設計してあります。

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