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(無題) 削除/引用 No.1383-3 - 2013/01/28 (月) 15:02:38 - ~ >類似した実験のを行なっている論文を参考にしたのですが、CoAエステル由来の脂肪酸が抽出できなかった原因としては何が考えられるでしょうか。 結果を確認していないすべてのステップが原因の候補となります。 少なくとも下記のいずれかが起きていれば、最終的なGCでの測定結果に期待する測定対象が含まれなくなる場合があるでしょう。 ・目的酵素が発現していない →SDS-PAGE, WBでタンパク質の確認をしているか ・発現しているがもともと活性がない ・発現していてその酵素が本来持つ活性はあるが、期待する酵素活性ではない →（できるのであれば）Wholeでタンパク質量、酵素活性を確認しているか ・菌体の破砕が不十分で回収率が極端に低い ・ミクロソーム画分が回収できていない ・超遠心機の表示と実際のgが異なっており、ミクロソーム画分が回収できていない →コントロールとなるタンパク質で、画分の回収の確認を行っているか ・試薬の取り間違え ・試薬の濃度間違え ・ウォーターバスの設定と実際の温度が異なっているため、反応が進まないまたは酵素が速やかに失活した ・アラキジン酸とサンプルの濃度があっておらず、測定対象物が測定下限未満 ・測定方法はアラキジン酸にはあっているが、測定対象物には不適 ・GCの設定を間違えていて、測定対象物の部分のデータをとっていない →類似の実験で使われていた酵素で確認をしているか ・反応前までのステップで失活した ・目的酵素がミクロソーム画分にない ・破砕条件が厳しく、酵素が失活した ・同じ画分に反応を阻害する物質が含まれている ・その他の反応系構成成分が目的酵素では不十分 ・逆に、酵素反応を阻害する成分まで入れている →酵素特有なので、個別の対応が必要

(無題) 削除/引用 No.1383-2 - 2013/01/28 (月) 10:00:57 - qq アラキジン酸抽出以外のすべてのコントロールは、どうなっているのでしょう？

脂肪酸CoAのけん化、抽出 削除/引用 No.1383-1 - 2013/01/27 (日) 00:26:27 - ボン太 いつも勉強させていただいています。 現在、脂肪酸修飾酵素の研究を行なっています。 酵母で目的酵素を発現させ、菌体を破砕して超遠心分離でミクロソーム画分を回収しました。 活性の確認を行うために、この画分と基質である脂肪酸CoAエステル、その他の反応系構成成分を混合して反応させ、 10% KOH in MeOHを添加して85℃のウォーターバスで2時間振盪（チオエステル切断）後、 HClを添加して酸性化させた後にクロロホルム-メタノールによる抽出を行いました。 このサンプルをメチルエステル化してGC解析を行いましたが、添加したCoAエステル由来の 脂肪酸および酵素反応産物が全く検出されませんでした。 類似した実験のを行なっている論文を参考にしたのですが、CoAエステル由来の脂肪酸が抽出できなかった原因としては何が考えられるでしょうか。 クロメタ抽出の際に内部標準としてアラキジン酸を添加し、GCでも検出されていることから、クロメタ抽出以降の操作には問題が無いと思われます。

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