>[Re:3] ふぃっくすさんは書きました :
> 確かにCHXでされてる論文も多く見ますが、加えた時点ですべての蛋白合成が止まるので、細胞周期だけでなく、諸々のプロセスが変化するはずで、それでいいのか、というのは論文審査でもしばしば指摘されます。
> RIでもタグなどをつけた発現系を使うのでなければ、同位体ラベル＞マスしかないんじゃないですかね。確か、核孔蛋白が異常に長い寿命を持つことが証明されたのも、その方法だったような。
マスの系は見たことがありませんでした。定量が難しくうまくできたんだろうかとおもったり。。。タグなしであれば特異的抗体のIPがポピュラーじゃないでしょうか。特別なものであれば精製した時のプロファイルからシグナルの強さをみるというのはあるかもしれません。NADなどにつくたんぱくならそのあフィニティで精製して、イオン交換HPCLでそのタンパクがくるいちの放射活性とか見るという感じで
>[Re:2] TK-1さんは書きました :
> 半減期が比較的短いものであれば、CHXを加えてタイムコースを取ってウェスタンで何時間で半分になるか、あるいは検出できなくなるかで結論つけれないもんでしょうか？methionine labelの場合、radioactivityの問題もあるし、IPをできる抗体がないとできない。タグ付きでやると（誰かの質問にありましたが）はじめに発現させすぎると分解系が追いつかなくなって、どこまで本当のことを見ているのかわからない。もちろんCHXを加えるとcell cycleも通常の状態と同じという訳にもいきませんからcell cycle-dependentの蛋白なんかはartifactがでるのかもしれませんが、over-expressionよりは現実に近い気がする。
おそらくご存じと思いますが、CHXで数字が出た場合それでどの程度よしと思うのかだとおもいます。強制的に発現を止めるわけですから、ホメオスタティックな制御が動くだろうという想像はできますから。
RIの問題の指摘ありがとうございました。過剰発現はいろいろと問題がありますね。
細胞周期依存性のタンパクは難しいもしれませんね。そもそも細胞の周期がそろってないうえ、フェイズによって半減期が変わるとするならばCHXにしてもRIにしてもフェイズをそろえないといけないわけで、、、それだとフェイズをそろえてライセーとで分解活性を見た方が(確かにそれはそれで系の保障がないわけですが)。。。 |
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