BioTechnicalフォーラム [16S rDNAの両端が読みたい。]

16S rDNAの両端が読みたい。

No.1364-TOPIC - 2013/01/21 (月) 18:01:42 - ビガチュウ

　いつも勉強させていただいております。

　バクテリアゲノム上の16S rDNAの配列全長を読みたいと考えています。
現在は例えば8Fと呼ばれているプライマーと下流のプライマーでPCRを一度おこない、これを鋳型として配列を読んでいます。
　この方法だと、プライマーの配列部分までしか当然読めません。16S rDNAの上流および下流の200bpほどを読みたいのですが、良いユニバーサルプライマーをご存知の方はいらっしゃらないでしょうか？
　下流に関しては、23S内の保存領域にプライマーを組むことで解決しましたが、上流の200bpほどが読めなくて困っています。
　例えばrDNAオペロンのプロモーター領域といった16Sの上流に保存領域は無いのでしょうか？
　もしくは、ゲノムダイレクトで配列が読めるといった情報をご存知の方がいらっしゃったら、教えていただけると助かります。

　どうぞよろしくお願いします。
　

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No.1364-8 - 2023/01/25 (水) 12:54:25 - 貝

こんにちは。
私の知り合いの先生は、16Sの最下流にFプライマーを設計し、そのずっと下流にある16Sコピー遺伝子の上端にRプライマーを設計してPCRを行ってシーケンスしていました。
配列は非常に長くなるのですが、16SrRNAのようにコピーごとの配列に変異が無い遺伝子であれば可能です。

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No.1364-7 - 2013/01/22 (火) 18:35:02 - AP

inverse PCRやadaptor ligation mediated PCRでいいんじゃないか。

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No.1364-6 - 2013/01/22 (火) 12:42:59 - KEN

>>ビガチュウさん
私もinverse PCRで行くのが無難な気がします。。。

もしくは、今出ているシークエンス結果を元に、BLASTにかけて、比較的近いものから、テキトーな感じで混合塩基入りのプライマーを何本か作成しておいて、手当たりにPCRするかもしれません。力技かもしれませんが、無難な気が。

探してみたら、このようなキットも。。。
http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100006568

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No.1364-5 - 2013/01/22 (火) 10:41:41 - ビガチュウ

　おお様。

　コメントありがとうございます。
　おっしゃるとおりRNAのほうからアプローチすればよいのですが、
諸事情ありまして、手元に精製されたゲノムしかありません。
　元菌を培養することもできないので、ゲノムを読む方向でしか
アプローチができません。

　ゲノムから行くのはやはり難しいでしょうか？

(無題)

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No.1364-4 - 2013/01/22 (火) 07:40:07 - おお

Oh, it is talking about DNA... Then, inverse PCR is one of possible approaches.

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No.1364-3 - 2013/01/22 (火) 00:45:37 - inverse PCR

http://en.wikipedia.org/wiki/Inverse_PCR

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No.1364-2 - 2013/01/21 (月) 18:05:18 - おお

http://en.wikipedia.org/wiki/Rapid_amplification_of_cDNA_ends