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(無題) 削除/引用 No.1361-11 - 2013/01/23 (水) 05:51:46 - おお >[Re:10] Harmoniaさんは書きました : > まずはおおさんの最初の書き込み > ＞ついでにさいしょのPCRが成功しているのはどういうふうに評価したのでしょうか? > への回答をお願いいたします。 > じつは、最初のシャープなバンドが偽物で、それを鋳型にしたらスメアになったとか。 一度回答の書き込みがあったような気がしたけど。。。 こういう質問したので意図が分かっていただけるかなぁとおもったのですが、電気えいどうで、サイズがあっているからという返事だったような気がしますが。。。 偽物かもしれませんから配列をよむか、少なくとも制限酵素などをつかって期待されるフラグメントがえられるか見てほしいということだったのですが。。。 さらにそれでも正しいと思っていても、ノンスペのわずかなバックグランドがキャリーオーバーされることがありますから、最初のPCRは厳し目に設定した方がいいと思いますね。ばあいによってはバンドが見えないくらいのサイクル数でもいいとも思ったりしますが、少ないとカラムで精製して得られるかなあという心配はあります。 nested なら精製をしなくても比較的安心できますから、そういう方法も考慮を入れたらいいと申し上げています。

(無題) 削除/引用 No.1361-10 - 2013/01/22 (火) 22:27:20 - Harmonia まずはおおさんの最初の書き込み ＞ついでにさいしょのPCRが成功しているのはどういうふうに評価したのでしょうか? への回答をお願いいたします。 じつは、最初のシャープなバンドが偽物で、それを鋳型にしたらスメアになったとか。

(無題) 削除/引用 No.1361-8 - 2013/01/21 (月) 09:31:34 - 中年 PCRでランダムに変異を導入しようとして、最初のPCR産物の1/100を鋳型に次のPCRを、さらにその産物の1/100を鋳型に次のPCRを、と繰り返したことがあるのですが、３回目くらいで全く増えなくなりました。その時は、熱で壊れたdNTPsかprimerが悪さをしているのかと思ったのですが、追求しないでそれきりになっています。そういうこともあるということで。

(無題) 削除/引用 No.1361-7 - 2013/01/21 (月) 07:34:38 - おお KENさんのいう通り、回し過ぎ、テンプレートのおおすぎはトラブルのもとです。テンプレートとプライマーによって程度のさはありますが、ノンスペがだんだん増えていくものだとおもいます。 ただゲルから切り出してさらにもう一度PCRをするというのはやる人もいて、テンプレートとプライマーによってはできるものですし、たいへんいいコンビネーションであればテンプレートがまあまあ多くてもきれいにターゲットのDNAがふえてくれます 。 いろいろな可能性が考えられると思いますが、やはりそのテンプレートにたいしてプライマーがベストでないか、テンプレートの配列がノンスペを増やし安いふうになっているかもしれません。 プライマーをデザインしなおすか、nested PCRという方法もありますので(これもプライマーを少なくともあとひと組ひつようですが)そういうのを検討してみればどうでしょうか。 いまのプライマーでということならまあアニーリング温度を上げたり、伸長反応時間を短く取ったり(長いノンスペがへる)、ベタいんやDMSOを加えたり、違うタイプの酵素をためしたり、cDNAのソースなどを工夫したり(スペシフィックプライマーで目的のRNAだけRTするとか、mRNA精製してからRTするとか、もっと発現の高い材料をみつけるとか)というのは一応可能ですけど。

(無題) 削除/引用 No.1361-6 - 2013/01/20 (日) 22:40:15 - KEN 2nd PCRしたらスメアになったということでしょうか？ スメアの形は、上の流し始めのところから尾を引くようなスメアではないでしょうか？ それは、テンプレートの濃度が濃すぎor サイクル数が多すぎるだけかと。 どうしても濃度が濃い＆たくさんのPCR産物を作りたいならば、全体のボリュームを増やしておいて同じテンプレート量で(テンプレートの濃度は薄くなる)、PCRを行い、後でエタ沈すればよいです。

プライマーセットは同じ？ 削除/引用 No.1361-4 - 2013/01/20 (日) 17:26:50 - たろう 最初のcDNAをテンプレートにしたPCRと、次のPCR産物をテンプレートにしたPCRとで、もしかしてプライマーセットが違うのでしょうか？ そうだとしてもそうでないとしても、PCRは実験書がたくさんあるので、まずは実験書を読むべきだと思います。 実験書の選択に迷うならば、基本原則として版を重ねたもの・実験原理がきちんと書いてありそうなもの・比較的新しいものが私の経験良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1361-2 - 2013/01/20 (日) 15:59:28 - おお >[Re:1] エンジンさんは書きました : > 初心者です。 > cDNAをテンプレートにしたPCRが成功するのに、そのバンドをゲル抽出したサンプルをテンプレートにしたPCRが失敗（スメアになる）ことの原因は何が考えられますでしょうか？ > サイクル条件は同じにしていますが、アニーリング温度が低いことは関係ありますでしょうか？ > ご教授よろしくお願い致します。 2回目のPCRでアニーリング温度下げてるんだと条件はちがうんだけど。。。もしそうだとすればどうしておなじ条件でやらなかったかも疑問だけど、なんか考えがあって下げたにしても、なぜもとの条件も試さないのかも疑問だけど、2回めのPCRはテンプレート量も多くなるから、回し過ぎか、テンプレートの量が多すぎというのも考えられるかもしない。最初のRCRの条件も厳しくしてみる選択肢もありますし、、、 ついでにさいしょのPCRが成功しているのはどういうふうに評価したのでしょうか?最初のRCRの条件も厳しくしてみる選択肢もありますし

PCR 削除/引用 No.1361-1 - 2013/01/20 (日) 15:46:10 - エンジン 初心者です。 cDNAをテンプレートにしたPCRが成功するのに、そのバンドをゲル抽出したサンプルをテンプレートにしたPCRが失敗（スメアになる）ことの原因は何が考えられますでしょうか？ サイクル条件は同じにしていますが、アニーリング温度が低いことは関係ありますでしょうか？ ご教授よろしくお願い致します。

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