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(無題) 削除/引用 No.1360-6 - 2013/01/26 (土) 07:41:17 - モモ 目的の蛋白のサイズが大きいなら１０％のゲルは不適切ですよね。 もっと薄いゲルを使って分離すると情報が増えると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1360-5 - 2013/01/25 (金) 13:36:12 - Atail > ウエスタンで２５０ｋD以上は普通はあまりみないところなので25ｋDの意味でしょうか？ > それとも6％のゲルとかで本当に250ｋD以上を見ているんですか？ そうです、10%ゲルで250kより上、wellから少しゲル内に入った位置にバンドが出ます。目的タンパクがかなり大きいサイズなので、wellのすぐ下からブロットしております。 > ビーズは何よ。もしか直接結合させるんじゃなくて、protein A ビーズとか protein Gビーズとかそっち系？。IPは溶出のときにSDS sample bufferとかでやる事多いけど、だとprotein AとかGがちゃんとビーズにくっついてないやつがどうしても一部漏れるのでそれが溶出画分に混入してるんじゃね。Protein A とかって一度変性させても結構タフでwesternの時使う抗体IgGと膜上で反応してラダーというかスメアっぽい強いシグナルを呈すことあるよ。抗体を直接ビーズにくっつけるやつにするか、溶出方法を変性剤でなくて抵pH溶液（pH(2.0)くらい）とかで行うとかで改善すると思う。 なるほど、勉強になります。ご指摘の通りproteinGを使っております。今現在抱えている高分子ラダリングとはサイズが合わないですが、過去のIPを思い返してみるとあてはまることがあるように思います。 > 濃い気がします、色々と。 > 抗体はちゃんとしたモノなのでしょうか。 血清量を見直しましたが確かに過剰と言える量でした。ひとまず精製したIgGでIPをしたところかなり改善されたのですが、なお4,5本ラダー状のバンドが見られます。近々別のウサギポリクロ血清が届くので、抗体に問題があるのか、手順等に問題があるのか、いま一度確認したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1360-4 - 2013/01/23 (水) 21:09:43 - モモ 同じ種の抗体でIPとIBをしたら、IP時に使用した抗体がサンプル内に残っているためIBの2次抗体で反応しますよね。サイズは25ｋDと50ｋDですが、寮が多いのでスメアを引きますよね。 ウエスタンで２５０ｋD以上は普通はあまりみないところなので25ｋDの意味でしょうか？ それとも6％のゲルとかで本当に250ｋD以上を見ているんですか？

(無題) 削除/引用 No.1360-3 - 2013/01/23 (水) 00:17:02 - qうぇrちゅいおp＠ ビーズは何よ。もしか直接結合させるんじゃなくて、protein A ビーズとか protein Gビーズとかそっち系？。IPは溶出のときにSDS sample bufferとかでやる事多いけど、だとprotein AとかGがちゃんとビーズにくっついてないやつがどうしても一部漏れるのでそれが溶出画分に混入してるんじゃね。Protein A とかって一度変性させても結構タフでwesternの時使う抗体IgGと膜上で反応してラダーというかスメアっぽい強いシグナルを呈すことあるよ。抗体を直接ビーズにくっつけるやつにするか、溶出方法を変性剤でなくて抵pH溶液（pH(2.0)くらい）とかで行うとかで改善すると思う。

(無題) 削除/引用 No.1360-2 - 2013/01/20 (日) 08:22:07 - う 普通のことではありません。 もちろん、抗体の質も関係あるでしょうし、 ライセートの濃度や、ウエスタンへのサンプルの使用量 抗体の濃度などなど、 原因には結構検討すべきところがあると思います。 まずは市販のプロトコール集で、冷静に確認をお勧めします。 長くなるので、二言だけ。 濃い気がします、色々と。 抗体はちゃんとしたモノなのでしょうか。

IP後の高分子バンド 削除/引用 No.1360-1 - 2013/01/20 (日) 07:30:02 - Atail ウサギポリクロでIPをしています。IP後に同じ抗体でウエスタンすると、250kDaより高い位置にラダー状のバンドがたくさん検出されるのですが、これは普通のことでしょうか？時にはラダーすら見えず真っ黒になってしまうこともあります。実験条件は以下の通りです。 ・IPには血清を使用。ビーズ結合後にIPバッファで３回洗浄し、Lysateと混和。 ・WBには同ロットの血清から精製したIgGを使用。 ・内在性、一過性発現（IPのポジコン）サンプル共に同様の現象が見られる。 ・コントロール血清（免疫化前の血清）でも同様の黒いバンド。 真っ黒に検出されるのは、二次抗体が反応しているように見られます。これは抗体の精度によるものなのでしょうか、IPの経験が浅いもので、原因に見当がつきません。何卒ご教授頂ければ幸いに存じます。

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