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近接したSalI-NdeI切断部位の２重切断 トピック削除
No.1358-TOPIC - 2013/01/19 (土) 08:30:58 - 初心者
pREP1というベクターのマルチクローニングサイトにあるNdeI-SalI認識部位を使って遺伝子をクローニングしたいと思っています。
CATATGTCGAC
がNdeIとSalIの配列で、切断部位が近接しています。
２重切断が可能か心配しています。
どなたか、経験のある方、アドバイスをいただけると助かります。
　
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3-fragments ligation 削除/引用
No.1358-8 - 2013/01/20 (日) 18:30:35 - mon
pREP1のSal１−NdeI部位からかなり離れた部位を１箇所のみ切断する酵素Xがあれば、
3-fragments ligationも可能です。
X−Sal１＋目的インサート＋Nde1-X　です。
Amp耐性plasmidであれば、Sca1が使える可能性があります。

近接したSalI-NdeI切断部位の２重切断 削除/引用
No.1358-7 - 2013/01/19 (土) 15:33:13 - 初心者
インサートは、NdeI-SalIサイト付きのPCR断片をTOPO-Bluntの中にクローニングしたものです。
ここから、NdeI-SalIで切り抜いてきて、SalIのTCGのフレームでpREP1ベクターにつなぎかえようとしていました。
目的は遺伝子のC末端をFlag-tagと融合することです。

TOPOの中にたまたまNdeの外側にXhoIがくるように入ったクローンを拾って、XhoI-SalIでpREP1のSalIにクローニングして、あとで方向を確認するという次善の策も考えられるので、試してみようと思います。

SalIに何かを以前に入れたものが残っていれば、
おおさんのアイデアのように、NdeIで切断を確認後にSalIできる方法を行いたいともいます。

(無題) 削除/引用
No.1358-6 - 2013/01/19 (土) 15:16:07 - Harmonia
入れる断片をPCRで調製するのか、別のベクターから切り出していれるのか
で、攻め方が変わります。

また別の観点で、読み枠のずれを気にするかしないかも、攻め方に影響します。

さらに別の観点で、入れたいインサートにNdeIやSalIがあるかとかも。

そのあたりの情報は？

近接したSalI-NdeI切断部位の２重切断 削除/引用
No.1358-5 - 2013/01/19 (土) 15:05:09 - 初心者
ありがとうございます。
やはり難しいのですね。

SalIにダミー配列を入れておいて、NdeIからきっていくアイデアは思いつきませんでした。
試してみようと思います。

ありがとうございました

(無題) 削除/引用
No.1358-4 - 2013/01/19 (土) 14:30:21 - おお
ファーめんたすにそういう情報がのっているんですね。さいきんのNEBよりちゃんとしてるかも。。。

ダメ押しでもう一つそのクローニングサイトに近いところでプライマーを作ってプラスミドごと増幅させて一方のプライマーはNdeIをつぶしたプライマー片方はSalIをつぶしたプライマーにしてどちらかで必ず切れるようにして、そのPCRプロダクトにインサートをいれる。

ただPCRプロダクトだと輪をかけてSalIは難しくなるかも、、、NdeIはそういうのにはあまり使わないし、、、

それにプラスミドをPCRというのは気持ち悪さもある程度のこるし、問題が起こることもまあある。。。

ということでいろいろ書きましたけど、アダプターを使うとかタグ付プライマーでインサート増やし入れやすい状態にした方がやはり早いかもと思いました。

(無題) 削除/引用
No.1358-3 - 2013/01/19 (土) 13:23:46 - AP
どちらで先に切っても、次の酵素の認識サイトが末端から1 bpしか離れていないようです。それらの酵素は、認識配列が末端から3 bpは離れていないとほとんど切れません（Fermentasの資料による）。Nde1はそういうきわどい条件でなくても切れにくい酵素ですしね。

もし、Sal1のかわりにHinc2が使えるなら、Nde1で完全消化してからHinc2ならいけそうに思います。

(無題) 削除/引用
No.1358-2 - 2013/01/19 (土) 12:04:38 - おお
きばどいね。酵素の選択もベストでない感じだし。。。それでやってダメなら、、、

Sal Iで切って、何かSal Iフラグメントのダミィー(スペーサー)をいれてから、NdeIで切って消化したことを確認してそれをSalIできるとか、、、

って地道なやり方もあるけど最近はそんな細かいことはする人いないかもねぇ。

近接したSalI-NdeI切断部位の２重切断 削除/引用
No.1358-1 - 2013/01/19 (土) 08:30:58 - 初心者
pREP1というベクターのマルチクローニングサイトにあるNdeI-SalI認識部位を使って遺伝子をクローニングしたいと思っています。
CATATGTCGAC
がNdeIとSalIの配列で、切断部位が近接しています。
２重切断が可能か心配しています。
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