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ありがとうございました。 削除/引用 No.1349-6 - 2013/01/18 (金) 17:14:10 - 発現太郎 完全に初歩的なミスをしておりました。 皆様、どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1349-5 - 2013/01/18 (金) 11:34:53 - Q もう答えは出た気がするけど、 まずは、基本に戻って ベクターを導入してない大腸菌と比較やってみる気概を持とうよ。

(無題) 削除/引用 No.1349-4 - 2013/01/18 (金) 03:37:13 - おお >[Re:3] qqさんは書きました : > ＞大腸菌（予備的にDH5aを使用しています）で発現させると > DH5aで発現させるのは、無理でしょ？ > T7-polymeraseを発現するコンピを使わんと無理よ。 > あ、ほんとだ。見落としてた。バンドはノンスペの可能性が高いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1349-3 - 2013/01/18 (金) 03:15:40 - qq ＞大腸菌（予備的にDH5aを使用しています）で発現させると DH5aで発現させるのは、無理でしょ？ T7-polymeraseを発現するコンピを使わんと無理よ。

(無題) 削除/引用 No.1349-2 - 2013/01/18 (金) 02:13:20 - おお >[Re:1] 発現太郎さんは書きました : > シーケンスやHis抗体でのWesternなど最終的な判断材料が不足しているのは承知しているのですが、このような理解しがたい現象は起こりうるのでしょうか？ 起こり得ます。でもシーケンスは確認してください。ほんとにそれが起こっているか決めるのが先です。

組み換えタンパクの分子量が予想とあいません。 削除/引用 No.1349-1 - 2013/01/18 (金) 01:10:43 - 発現太郎 いつも勉強させていただいています。 現在、pET-28a(+) のNde1/EcoR1サイトにあるタンパク質の一部の断片（約350bp）のインサートを挿入して、組み換えタンパクを発現させようとしています。 サブクローニングの確認では、コロニーPCRポジティブのものを、Nde1/EcoR1で制限酵素処理し、350bp付近に非常に薄いですがバンドが出ることを確認しました。（エチブロ染色は後染めにも関わらずです） 予想では10kDa付近に出るはずのバンドが、いざ大腸菌（予備的にDH5aを使用しています）で発現させると、CBB染色では約50kDa付近にIPTGによって特異的に誘導されたバンドが確認されます。フレームがずれるにしても大きすぎると思うのです。 異なるコロニーから抽出したプラスミドでも同様の結果が得られます。 シーケンスやHis抗体でのWesternなど最終的な判断材料が不足しているのは承知しているのですが、このような理解しがたい現象は起こりうるのでしょうか？

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