全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1345-14 - 2013/01/19 (土) 19:23:40 - GE み様、アドバイス有難う御座います。 今回のデータだけでは、見方によって良いようにも悪いようにも解釈できそうですね。 み様のアドバイスのように、他の系で見てみて総合的に判断するのがよさそうですね。 他の系でも進めていこうと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1345-13 - 2013/01/19 (土) 17:53:17 - おお >[Re:11] GEさんは書きました : > アドバイス有難う御座います。 > > このような結果をみたときに、結合していると判断できますでしょうか？ 最初に厳しいと申し上げました。てか、私に聞いているわけではないのかな。

(無題) 削除/引用 No.1345-12 - 2013/01/19 (土) 13:57:56 - み 周辺データがそろわないと何とも言えないけど、以下のことが気になる。 targetでないであろうと思われるGAPDHの領域でもnormal IgGと比較して5倍多く沈降させている。 qPCRの5倍と10倍でどれほど違うのかなあ？1サイクルですよね。 極論、GAPDHでない他の複数領域を増幅させたら20倍多く増幅できるものも簡単に見つけられるのでは？ この辺りのデータはnegative controlの取り方次第で都合の良いデータは簡単に作れるのだが・・・。 そもそも沈降効率も悪そうだし、抗体の特異性(他の蛋白も色々と沈降させているのでは？）もどうなのかと思う。 �@異なる特異抗体で同様の結果がでるか �A他の抗体が入手不可能ならtag付加蛋白を強制発現させてtag抗体で落とすとか �BEMSAなど他の手法でタンパク-DNA間の相互作用の特異性が確認できるか

(無題) 削除/引用 No.1345-11 - 2013/01/19 (土) 09:54:48 - GE アドバイス有難う御座います。 イメージ的には、ターゲットとする領域での結合がnormal IgGと比較して10倍程度上昇しており、なおかつ、結合しないであろうと予測される領域（GAPDHプロモーター領域やコーディング領域）での結合がnormal IgGと同程度であることを期待しておりました。 normal IgGに比べてきちんと差が出ているので、ターゲットとする領域に結合しているとは思うのですが、結合しないであろうと予測される領域との結合（非特異的結合？）と比較して2倍程度なので、このくらいの数値の上昇でターゲットとする領域に結合していると言えるのかどうか思案しています。 このような結果をみたときに、結合していると判断できますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1345-10 - 2013/01/19 (土) 08:12:54 - おお >[Re:7] GEさんは書きました : > アドバイスありがとうございます。 > > 初歩的な質問で申し訳ありませんが、断片化をもっと短くすれば（1-0.2ｋぐらい？）、結果は変わってくるものでしょうか？ 一般論ではありますがちゃんと断片かするほうがいいときいています。経験論でそこは大丈夫そうだという意見もあがっていますけど。 長いのが交じるとPCRで評価している部位と別の部位でタンパクがついているのにもかかわらず、バンドが検出されるということは考えないといけない場合もあります。 EMSAなどはしてますでしょうか?配列非依存的なあふぃにティーがどの程度あるのかなぁと思いまして、、、

(無題) 削除/引用 No.1345-9 - 2013/01/19 (土) 08:03:20 - おお >[Re:8] みさんは書きました : > >[Re:7] GEさんは書きました : > 僕は断片化を強くしても結果はあまり変わらないと思う。 > むしろ抗体の特異性と沈降効率を改善する努力をすべきかと。 > 使用している抗体がイマイチな場合は厳しいでしょうが・・・。 > > 樹脂よりmagnetic beadsを使用すべきなのは言うまでもないですね。 抗体の特異性を評価するのは示された実験だけでは判断できませんが、非特異的吸着はnormal IgGを使って評価していますよね。活性化の時はそれと比べて10倍あるとしています。どうでしょうか、もうちょっと差がある方がいいとお考えでしょうかCt値のさでいうなら3と4の間ですよね。。。

(無題) 削除/引用 No.1345-8 - 2013/01/18 (金) 12:07:05 - み >[Re:7] GEさんは書きました : > アドバイスありがとうございます。 > > 初歩的な質問で申し訳ありませんが、断片化をもっと短くすれば（1-0.2ｋぐらい？）、結果は変わってくるものでしょうか？ > > 僕は断片化を強くしても結果はあまり変わらないと思う。 むしろ抗体の特異性と沈降効率を改善する努力をすべきかと。 使用している抗体がイマイチな場合は厳しいでしょうが・・・。 樹脂よりmagnetic beadsを使用すべきなのは言うまでもないですね。

(無題) 削除/引用 No.1345-7 - 2013/01/18 (金) 10:46:40 - GE アドバイスありがとうございます。 初歩的な質問で申し訳ありませんが、断片化をもっと短くすれば（1-0.2ｋぐらい？）、結果は変わってくるものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1345-6 - 2013/01/18 (金) 08:38:22 - おお >[Re:5] GEさんは書きました : > アドバイス有難う御座います。 > > 断片化ですが、2ｋ-0.2ｋとブロードですが断片化されております。 > > qPCRです。UVクロスリンクは初めて聞きます。 UVクロスリンクはRNAではよく使われますがCHIPではあまり使わないかもしれませんね。一般的には2本鎖より1本鎖のほうが有利といわれているようです。 フォルムアルデヒドである程度条件を振ってみてもいいかもしれません。 断片かに関してはヌクレアーゼを使う方法もあるので、ソにケーションでやっているなら試してみる価値はあるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1345-5 - 2013/01/17 (木) 08:48:32 - GE アドバイス有難う御座います。 断片化ですが、2ｋ-0.2ｋとブロードですが断片化されております。 qPCRです。UVクロスリンクは初めて聞きます。

(無題) 削除/引用 No.1345-4 - 2013/01/17 (木) 01:41:57 - おお しょせんクロスリンクなので、間接的についている物が IPされている可能性もありますので、クロスリンク自体を工夫してみてもいいかもしれません。結合している状態でDNAの鎖が解けているならUVのクロスリンクも有効の可能性があります。UVはタンパク間のクロスリンクを作りにくいと考えている人もいるようです。

(無題) 削除/引用 No.1345-3 - 2013/01/17 (木) 01:08:32 - おお 正直もう少し差が欲しいいところです。qPCRでしょうか、ゲル上での判断でしょうか?えいどうしているなら、さちゅレーションしているところで見ていて差が縮まって見えているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1345-2 - 2013/01/16 (水) 22:31:12 - ふみ 断片化はきちんとできているのでしょうか？

ChIPの評価 削除/引用 No.1345-1 - 2013/01/16 (水) 21:32:15 - GE ある転写因子が、あるプロモーター領域に結合するかどうか見るためにChIPを行っています。 これまでに、この転写因子に対する抗体を使用してChIPし、その後WBしたところ、0.1%Input程度のバンドが見られたので、一応、ChIPでこの転写因子自体は回収できていると考えております。 また、この転写因子に対する抗体でChIPしたという論文がないので、結合しない領域の情報がありません。 このような状況で、とりあえず、この転写因子に対する抗体およびネガコン抗体（normal IgG）でChIPし、リアルタイムPCRを行ったところ、ターゲットとする領域では、ネガコン抗体に比べ転写因子に対する抗体では10倍程度値が上昇しておりました。 しかし、結合しないであろうと予測される領域（GAPDHプロモーター領域やコーディング領域）でもネガコン抗体に比べ転写因子に対する抗体では5倍程度値が上昇しております。 このような状況で、10倍と5倍の差をどう評価するか思案しております。 ターゲットとしている領域に結合しているとみていいのかどうかアドバイスいただければ幸いです。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---