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(無題) 削除/引用 No.1339-9 - 2013/01/17 (木) 22:45:41 - qq ＞KENさん そうです。一つのcDNAからでるCt値に分散は必要ないので、異常値を弾くだけで結構でしょう。基本的には、異常値がないことを確認するためにtriplicateに持ち込むのでしょう。複数のcDNAからでるCt値やデルタCt値は、母集団のデルタCtを視野に入れているので、分散が付随するでしょう。n=3で評価できるかは別にして、一応、SDやSEMが出てくることになります。

(無題) 削除/引用 No.1339-8 - 2013/01/17 (木) 00:51:42 - KEN >qqさん >「勝手に異常値を取り除いてはいけません。」 それは、3ウェルとも別々のdishから別々に調製したcDNAという条件の元での話ですよね？ 今回は、3ウェルとも同時調整したものを入れているのではないでしょうか？ 以前、私がABIの営業の方に言われたのは、同時に調整したcDNAを3ウェル入れて行った方が、良いとのことでしたので。。。 この場合、明らかな異常値が、ピペッティングや気泡が原因と強く疑われる場合、勝手に異常値を取り除いても問題ないのではないでしょうか？ (例えば、一つだけ立ち上がらず、残り二つは等しいCt値を示している場合。ABIのソフトでも勝手に除外される仕組みになっていたかと思います。) >nekoさん qqさんとのやり取りでも書きましたが、3ウェルとも同時調整したcDNAか、3ウェルトも別々のdishから別々に調整したcDNAかによって、回答が変わってきます。どちらなのかを教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.1339-7 - 2013/01/16 (水) 19:33:29 - qq 読んでいて、良く判らなくなるので、 １）サンプルAとリファレンスBは、実験群、対照群と同じ意味です。 ２）biological replicateは、チェックボックスの話ではなくて、同一群の別々のdishから別々に調製したcDNAということです。 として、 3つの別々のcDNAからデルタCt値が3つ出てくるので、そこを統合すると、その群のデルタCt値の平均と標準誤差だか偏差だかが出てきます。 実際に評価するのは、群間のデルタCtの差（デルタデルタCt）なのだけど、ここで、その標準誤差だか偏差だかは、どうすりゃいいんだというと、誤差の足し算引き算と言うことを議論することになります。 計算で用いたデルタCt値の標準誤差の大きい方をデルタデルタCt値の標準誤差に使うというのが、普通の対応だと思います。 だから、「勝手に異常値を取り除いてはいけません。」と、いうことです。ああ、悩ましい。

(無題) 削除/引用 No.1339-5 - 2013/01/16 (水) 14:18:20 - neko 皆さま、回答ありがとうございます。 ＞「あ」さん 実験は細胞培養実験で、サンプルAとBは同じ培養用液から分注し、同時に実験開始したものです。 確かにあまり対応させる意味は無いですね・・・ となるとKENさんのいうとおり、ABIの推奨（？）である2.を実行するべきでしょうか・・・ 2.の方法を使うと標準誤差などが表示されず、RQ、RQ Max、RQ minが表示されるのですが、棒グラフを描く場合はRQ MaxとRQ minをエラーバーに使用すればいいのでしょうか。 私自身は標準誤差を使ったエラーバーしか書いたことが無いのでよく解りません。 質問ばかりですが、もう少し付き合っていただけるとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.1339-4 - 2013/01/16 (水) 11:28:10 - あ サンプルA1とリファレンスB1、A2とB2が対応するのは何故ですか？

(無題) 削除/引用 No.1339-3 - 2013/01/16 (水) 10:05:00 - KEN 基本的には、3ウェルとも同じ溶液を入れているんですよね？ これは、ピペット操作による誤差をなくすためだと思うのですが、ピペット操作に慣れていると、3ウェルでCt値はばらつきはほとんどありません。 よって、自分は、リアルタイムの場合、ライフテクノロジーズ(Applied biosystems)のソフトの仕様通り、3ウェルの平均をとって出しています。 ”2. サンプルA1〜A3のΔCtの平均と、リファレンスB1〜B3のΔCtの平均を比較する。 ” の方法でしょうか。 ラボによっては、3ウェルで繰り返さず1回勝負というところもあるようですが、私は最低でも2ウェルでやっています。。。 あまりにもおかしいものは除外しておりますが。(例えば、3ウェル中1つだけ立ち上がっていないとかやたらCt値が高すぎる。低すぎる場合は、もう一度やり直すか、一つのおかしいウェルを除外して平均値を出しています。)

(無題) 削除/引用 No.1339-2 - 2013/01/16 (水) 01:47:26 - おお 同じ反応溶液で出た結果同士で数字を出した方が安心は安心ですけど。 どれだけ実験１、2、3が厳密にテクニカルに再現しているのか、することが可能なのかというのもあるかもしれません。

比較Ctを用いたn=3での解析方法について 削除/引用 No.1339-1 - 2013/01/16 (水) 00:07:21 - neko 比較Ct法を用いて実験をしています。 1サンプルにつき3well反応させる実験を行い、これを3サンプル行うことでn=3としてデータをだそうと考えています。 実験１：サンプルA1とリファレンスB1 実験２：サンプルA2とリファレンスB2 実験３：サンプルA3とリファレンスB3 この場合、どちらの解析法が適当でしょうか。 1. 各実験ごとにRQ値を算出し、それをもとに全体のRQ値および標準誤差を算出する。 2. サンプルA1〜A3のΔCtの平均と、リファレンスB1〜B3のΔCtの平均を比較する。 ABI付属ソフトでBiological Replicatesという項目を使うと後者のような解析法になってしまうのですが、どちらで行うのが適当でしょうか。

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