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(無題) 削除/引用 No.1329-8 - 2013/01/14 (月) 23:21:44 - おお さいしょにヘパリンカラムにかけるっているのもあるね。

(無題) 削除/引用 No.1329-7 - 2013/01/14 (月) 19:21:22 - そのままアフィニティ精製 良いタグなら、濃縮なしで、そのままアフィニティ精製がエレガントでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1329-6 - 2013/01/13 (日) 01:13:07 - qうぇrちゅいおp＠ 培地の濃縮なら遠心してデブリ除いて、で硫安たくさん入れて飽和させて蛋白質沈殿させてから少量のbufferとかに再けんだくして、で適当なbufferに透析して硫安抜いて再溶解という流れが自分の中ではデフォ。沈殿するような濃厚溶液を膜で濃縮するのは、膜がすぐ目詰まりするし効率的にもやっぱあれだろ。

(無題) 削除/引用 No.1329-5 - 2013/01/12 (土) 14:44:08 - mon 血清10%を濃縮するとドロドロになりますので無謀ですね。 ITS＋血清で血清濃度を落とせないですかね。多分２％くらいまで減らせるような。 血清中のタンパクが多くて精製に難儀しますので、皆さんが指摘するように硫安分画、あるいは陽イオン交換カラム等（目的タンパクが吸着すればかなり有効）で、濃縮も兼ねつつ血清タンパク含量を減らすのが、早いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1329-4 - 2013/01/12 (土) 11:38:18 - おお >[Re:2] qqさんは書きました : > 2) 遠心条件が弱いように感じます。可能であれば、10,000xg以上で20分程度遠心する方がよいかなと思います。 わたしもそこがきになってました。0.2umのフィルターというてもあるとはおもいますが、血清はいっているしフィルターはしんどんね今回は。

(無題) 削除/引用 No.1329-3 - 2013/01/12 (土) 11:20:57 - おお 基本的にチェックしてからかんがえますが、溶液に実験に使うに十分の量が確認されるなら、デブリはむしするでしょう。 そもそもデブリのままではタグを使った精製はできないでしょうし(変性した状態とかデタージェントを使うなら話が違いますけど)。 一層のことタグで最初から回収できないでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.1329-2 - 2013/01/12 (土) 11:18:10 - qq 1) 仮にdebrisに組み換えタンパク質が検出されたとしても、可溶化できないと結局、そこから精製できませんよ。 2) 遠心条件が弱いように感じます。可能であれば、10,000xg以上で20分程度遠心する方がよいかなと思います。 3) 濃縮するのであれば、硫安分画（タンパク精製のスタンダードだとKornbergも言っている）という選択肢もありえます。硫安カットではありません。 4) 何より、濃縮しないとタグ精製できないのですか？

アミコンで濃縮/デブリスは回収しますか？ 削除/引用 No.1329-1 - 2013/01/12 (土) 10:57:32 - amikon お世話になります。 現在、FCS存在下で細胞を培養し、上清中へ分泌されたリコンビナント可溶性蛋白質を回収しています。事情によりITS（血清フリー）培地では作製できません。 その蛋白質にはC末にタグが付いており、アミコンで濃縮したサンプルからタグで更に精製を考えています。その蛋白質は約30 kDaで、dimer, multimerizationもとることで60もしくはそれ以上になります。（S-S結合です。） 細胞から上清を回収し、3000 rpm, 10 minでデブリスや細胞の死骸を落とし、キレイな上清をアミコン（10 K cut off）に供しています。 みなさまへの質問は、アミコンで濃縮し終えると、アミコンの溝にpackされたデブリスかなにかができると思います。そういうのもまとめてエッペンチュープに回収し、そこからbatch法で精製しようと思うのですが、そのデブリスが邪魔になってしまいます。 FCSが10 %も含有する培地なので、血清成分や落ちきれなかった細胞の死骸、デブリスかなと思いますが、ここに自分の目的の蛋白質があったら、、と思うとbatchを行う際に除くのに躊躇いが生じています。 もちろんそのデブリスをSDS-PAGEすればよいのですが、、、 みなさまならどうしますでしょうか？ エッペンチューブにアミコンで濃縮された上清とデブリスまとめて回収して、そのエッペンを15000rpm, 10 min程度更に遠心して、その上清をbatchに供すればよいでしょうか。。？ みなさまの考えを教えてください。 それでも今日、SDS-PAGEで確認はするつもりです。

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