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(無題) 削除/引用 No.13224-22 - 2026/03/11 (水) 04:53:32 - おお >[Re:16] 774Rさんは書きました : > > 分泌性の蛋白以外でもすんなり行くもんなんでしょうか？ > > だとすると原理的に細胞内タンパク質でも免疫可能だと思われます。 そういえばそういう経路があったことを思い出しました。癌で変異をした細胞内で発現する蛋白でも癌抗原ワクチンなどで使われてますしね。 > > > mRNAで抗体を作って精製して研究に使うような系はすでにありますか？なければある意味チャレンジングではあると思いますが。 > > 実際にやられてるのはplasmid DNAをマウスなどにTFして免疫する方法が確立されてるそうです。 なるほど。それで実際に抗体を精製するかハイブリドーマを作ったっていうことですか？

(無題) 削除/引用 No.13224-21 - 2026/03/11 (水) 04:49:40 - おお >[Re:17] 774Rさんは書きました : > > 293Tとかを利用して抗原を作る系も見たことがあります。 > > HEKなどに発現させて、細胞ごと免疫原として注射する方法がありますね。 > 昔、私も方法だけ考えて実行はしなかったのですが、Cell-based immunizationという名前でGPCR抗体作製では定番らしいです。 そういえば細胞表面抗原を得るために細胞を免疫したって話もあったと記憶してますね。

(無題) 削除/引用 No.13224-20 - 2026/03/10 (火) 17:55:37 - う BCRが認識しているのはタンパク質抗原で、MHCに載っているのがペプチドってことでしょ。抗体が認識しているのはタンパク抗原なのでは？

(無題) 削除/引用 No.13224-19 - 2026/03/10 (火) 15:28:27 - 樹状細胞 > 抗原提示されるペプチドはB細胞のHLA上に提示されるのであって、抗体の抗原ではないですよ。 > B細胞のHLA上に提示されたペプチドがヘルパーT細胞に認識されると、B細胞が抗体産生できるようになる。 そのような経路「も」ありますね。

(無題) 削除/引用 No.13224-18 - 2026/03/10 (火) 15:10:46 - ぽいう 抗原提示されるペプチドはB細胞のHLA上に提示されるのであって、抗体の抗原ではないですよ。 B細胞のHLA上に提示されたペプチドがヘルパーT細胞に認識されると、B細胞が抗体産生できるようになる。 なんか、勘違いしてない？

(無題) 削除/引用 No.13224-17 - 2026/03/10 (火) 13:33:01 - 774R > 293Tとかを利用して抗原を作る系も見たことがあります。 HEKなどに発現させて、細胞ごと免疫原として注射する方法がありますね。 昔、私も方法だけ考えて実行はしなかったのですが、Cell-based immunizationという名前でGPCR抗体作製では定番らしいです。

(無題) 削除/引用 No.13224-16 - 2026/03/10 (火) 13:26:43 - 774R > 分泌性の蛋白以外でもすんなり行くもんなんでしょうか？ ちなみにスパイクタンパク質はホモ3量体膜タンパク質で、分泌性ではないですが、しっかり抗体価があがってますね。細胞表面に完成形のスパイクタンパク質として提示されるのもありますが、細胞内でペプチドに分解され、MHCを介した抗原提示がされるのがメジャーな経路じゃないでしょうか。だとすると原理的に細胞内タンパク質でも免疫可能だと思われます。 > mRNAで抗体を作って精製して研究に使うような系はすでにありますか？なければある意味チャレンジングではあると思いますが。 実際にやられてるのはplasmid DNAをマウスなどにTFして免疫する方法が確立されてるそうです。

(無題) 削除/引用 No.13224-15 - 2026/03/10 (火) 05:39:00 - おお >[Re:12] weさんは書きました : > オーソドックスに大腸菌や培養細胞などで発現させたら封入体出来てしまいややこしそうな時は、無細胞系で蛋白質発現させるといいと、試薬の新製品広告か何か前に見たんだが。 293Tとかを利用して抗原を作る系も見たことがあります。

(無題) 削除/引用 No.13224-14 - 2026/03/10 (火) 05:36:11 - おお >[Re:13] mRNA枠沈さんは書きました : > なんなら、抗原をコードするmRNAをLNPで包んで、筋注すればいいんじゃないかな？ > 皆さんは風邪の予防接種で打ちましたか？ 分泌性の蛋白以外でもすんなり行くもんなんでしょうか？ mRNAで抗体を作って精製して研究に使うような系はすでにありますか？なければある意味チャレンジングではあると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.13224-13 - 2026/03/07 (土) 13:27:05 - mRNA枠沈 なんなら、抗原をコードするmRNAをLNPで包んで、筋注すればいいんじゃないかな？ 皆さんは風邪の予防接種で打ちましたか？

(無題) 削除/引用 No.13224-12 - 2026/03/07 (土) 13:05:30 - we オーソドックスに大腸菌や培養細胞などで発現させたら封入体出来てしまいややこしそうな時は、無細胞系で蛋白質発現させるといいと、試薬の新製品広告か何か前に見たんだが。量的なことが気になるけど、最近はいいkitもいろいろでてるみたいで、そこそこの収量得られるみたいだし。ポリクロ作るにしてもウサギでなくてマウスやラットで作成すれば抗原量も少なくて済むし。

(無題) 削除/引用 No.13224-11 - 2026/03/07 (土) 10:33:45 - 774R 結局、やられてることは、モノクロならELISAでネイティブなタンパク質に結合するクローンを選択するとか、ポリクロならネイティブなタンパク質でアフィニティ精製するとかくらいですよね。

(無題) 削除/引用 No.13224-10 - 2026/03/07 (土) 02:00:14 - おお >[Re:9] 774Rさんは書きました : > 変性してないタンパク質で免疫しても、結局はペプチドに分解されて抗原提示されるのでタンパク質の構造の内部を認識する抗体も作られます。したがって、WBでは反応するけどIPやIFには使えないものも作られます。 構造を認識する抗体を作るにあたって効率的では全くないですもんね。何か効率を上げる工夫とかあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.13224-9 - 2026/03/06 (金) 22:13:25 - 774R 変性してないタンパク質で免疫しても、結局はペプチドに分解されて抗原提示されるのでタンパク質の構造の内部を認識する抗体も作られます。したがって、WBでは反応するけどIPやIFには使えないものも作られます。 たまたま立体構造依存的な抗体も出来るけど、免疫する抗原タンパク質のフォールディング状態を反映するかどうかって、都市伝説ではないかと思ってる。

(無題) 削除/引用 No.13224-8 - 2026/03/06 (金) 17:42:08 - ぽいう 多分ウサギでウエスタン用なのでしょうけど、ウサギなのかマウスやラットハムスターなのか、モノクロかポリクロか、ウエスタン用かFACSや免疫染色用かはせめて書いたほうが良い

(無題) 削除/引用 No.13224-7 - 2026/03/06 (金) 13:15:21 - zzrb 抗体の目的にもよりますね。 WBに用いるような抗体の作製が目的であれば変性タンパク質の状態で誘導を行っても良いと思います。 ですが、変性タンパク質で誘導したした抗体は天然の(正しくフォールディングした)タンパク質を認識しない可能性もあるので、そういった場合は注意が必要です。

(無題) 削除/引用 No.13224-6 - 2026/03/06 (金) 12:33:01 - we ポリクローナル抗体/抗血清を作成するとき、抗原が封入体などの場合、分子シャペロン関連タンパク質が結合してたりするので、免疫するとそういうものの抗体も一緒にできる可能性が大きい。なので抗原タンパク質をSDS-PAGEしてゲルから切り出したほうがそういう可能性を減らせるので良いかもしれない（それでもマイナーなきょう雑タンパク質はどうしてもあるので、目指す抗体が全然できなくて、そういうマイナーなきょう雑タンパク質に対する抗体がたくさんできたりすることも珍しくない。抗体のできやすさは必ずしも存在量に比例しない）。毛髪や動物の体毛、皮膚、器具に付着している微細なほこり、その他いろんなものに由来するケラチンに対する抗体ができることも免疫の回数が多くなるとよくあるので、基本的に抗原の準備や免疫する際はなるべくクリーンな機材、環境で作業したほうがいい。SDS-PAGE gelからバンドを切り出すならばガラス板は使用前に洗剤でよく洗うとか、染色液も再利用でなく事前に新調するとかも大事。ただ、いずれにせよもし関係ないタンパク質の抗体ができて非特異的反応が目立つような場合でも、抗原が穏和な条件できるならば抗原カラム作成して抗血清をaffinity精製すればほぼ解決できるけど。 ある程度お金かけられるならば、抗原性を予測して適切な部域の抗原ペプチドを合成して、キャリアタンパク質に結合させるところまでメーカーに委託でできるので、そうして作成した抗原を免疫する方法もあるし、最近はそのほうが主流と思う。こういうのはいろんなメーカーがよく受託のキャンペーンもやってるので利用するといい。うまくいけばポリクローナル抗体でもエピトープの明らかなモノスペシフィックな特異性の高い良い抗体が得られる。ただ成功率はケースバイケースで（経験だと50%くらい）、やってみないとわからない的なところがあるけど。もしIPや免疫染色を予定してる場合は抗原ペプチドとする配列部位によっては使えないことがあるのでその辺りも抗原ペプチド配列の設計段階で委託先と検討したほうがいい。 モノクローナル抗体を作成する目的なら、抗原の純度や性状はそれほど大きな問題にはならないと思う。

(無題) 削除/引用 No.13224-5 - 2026/03/05 (木) 13:56:44 - よっしー 私も774Rさんの意見と同じです． 封入体はほとんどが目的タンパク質だと思いますので，精製の必要もないような気がしますが，774Rさんが仰るようにSDS-PAGEからの切り出しで十分なような気がします．ゲルを細かく砕いてPBSで懸濁しアジュバントと一緒に動物に打つことも可能だと思います．

(無題) 削除/引用 No.13224-4 - 2026/03/05 (木) 04:33:31 - おお >[Re:3] おおさんは書きました : > > 場合によってはEDTAなどもあるかなと思う。 逆に金属イオン加えているものもあるみたいだね。Mg++ Ca++とかがまず思いつくと思いますが、蛋白によってはZnイオンとか盲点かも。

(無題) 削除/引用 No.13224-3 - 2026/03/05 (木) 00:58:04 - おお いろいろ文献を当たれば、ここでたまたま見かけた人の組成より幅広いバッファー組成が見つかると思うよ。 Roufarshbaf M, Akbari V. Development of Solubilization and Refolding Buffers. Methods Mol Biol. 2023;2617:155-164. doi: 10.1007/978-1-0716-2930-7_10. PMID: 36656522. Solis-Andrade KI, Gonzalez-Ortega O, Govea-Alonso DO, Comas-Garcia M, Rosales-Mendoza S. Production and Purification of LTB-RBD: A Potential Antigen for Mucosal Vaccine Development against SARS-CoV-2. Vaccines (Basel). 2022 Oct 20;10(10):1759. doi: 10.3390/vaccines10101759. PMID: 36298624; PMCID: PMC9609574. Manissorn J, Tonsomboon K, Wangkanont K, Thongnuek P. Effects of Chemical Additives in Refolding Buffer on Recombinant Human BMP-2 Dimerization and the Bioactivity on SaOS-2 Osteoblasts. ACS Omega. 2023 Jan 8;8(2):2065-2076. doi: 10.1021/acsomega.2c05802. PMID: 36687022; PMCID: PMC9850730. キットとかもあるね。 https://athenaes.com/protein-refolding.html https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/89867 加えれそうなものはデタージェント、シュークロース、場合によってはEDTAなどもあるかなと思う。 個人的には蛋白によって最適な条件は違うだろうから色々と検討して良さげなものを絞っていくしかないと思う。これまで使われなかったものが有効だったりするケースもあるし。ある蛋白はニッケルカラムで溶出バッファーにHisが入っていてその状態で活性があったが、抜くとだめになったという話を見たことがある。 すでに指摘がありますが、単に抗体を作るだけなら変性した状態でも大丈夫です。封入体をそのまま動物に打つ場合もあるようです。

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