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(無題) 削除/引用 No.13211-16 - 2026/02/18 (水) 20:55:23 - r SDSを最終濃度0.02%でTransfer bufferに入れてやってます。MeOHは最終濃度20%です。昔はSDSは入れてなかったのですが、その時と比べると転写されるタンパク質の量や種類は確かに増えます. 0.1%ではかえってイマイチでした。SDSを入れると泡が出やすいです。bufferを入れたシリンダー等はあまり激しく降らないほうがいいです。あ

(無題) 削除/引用 No.13211-15 - 2026/02/18 (水) 08:39:34 - おお >[Re:14] おおさんは書きました : > その他の高分子のトランスファーを改善する他のチップとしては、 > > トランスファーバッファーの改善 ... > ゲルの改善 ... 追加でトランスファーバッファーにSDSをいれる。0.01%とかもっと微量なものを見たことありますが0.1%でやっているのも見たことがある。SDSはゲルからの溶出を促進するが、膜への結合を弱めると一般的に考えられています。

(無題) 削除/引用 No.13211-14 - 2026/02/18 (水) 02:30:02 - おお >[Re:12] うえすさんは書きました : > タンパク質濃度を何点か降ること、10％vs8%ゲルでの比較をしてみたところ、バンドがやや太く現れるようになりました。 > うまく転写されていなかったかもしれません。今後はゲル濃度を変えて行っていこうと思います。 均一ゲルでやるとき、ゲルの上から３分の１までの領域は転写の効率の影響を大きく受けるので、ゲルの濃度の選択の時の目安にすればいいかと思います。昔のバイオ・ラッドのプレキャストゲルの泳動パターンを示した図にはトランスファーに適した領域が色分けされいて、それが大体経験上三分の一あたりというのと一致していた。 前にも書きましたがウエットでオーバーナイトトランスファーをすると上から３分の１の領域のトランスファーもかなり改善されますし、最近は新しいトランスファーシステムも出てきて改善されているケースもあるようです。 > > トランスファー効率はゲル全体で均一なものかと思っていたのですが、言われてみれば10％ゲルからトランスファーするときは、マーカーですら250 kD付近のバンドが完全には転写されずゲル側に残っていることがよくあります。 感覚を掴むという意味でトランスファーしたあとのゲルをCBBなどで染めてみるといいです。絶対に毎回やらないといけないとか言うものではないですが、実験の各ステップでどのように（ちゃんと）ワークしたか確認する作業は大事です。実験系がブラックボックスになっていてアウトプットがバラけるというのが混乱の原因になりえるし、確認できる各点での状況を把握しておくとトラブルシューティングもしやすいので。 その他の高分子のトランスファーを改善する他のチップとしては、 トランスファーバッファーの改善 メタノール濃度を下げる（１０％とか場合によっては５％）、ただし低分子の吸着量は減るかも。 高いpHのバッファーをつかう（蛋白をよりネガティブにチャージさせる）。 ゲルの改善 0.75 mmとか薄いゲルを使う。載せれるタンパク量、容量は減りますが、解像度も上がるので感度的にはそこまで心配しなくてもいい。

(無題) 削除/引用 No.13211-13 - 2026/02/17 (火) 13:01:23 - ぽいう バンドがシャープになりません！ってのはよく聞くけど、バンドが太くなりませんというのは贅沢な悩みというか、みんなと同じじゃないと心配性？

(無題) 削除/引用 No.13211-12 - 2026/02/17 (火) 09:52:48 - うえす 引き続きコメントいただいており、ありがとうございます。 タンパク質濃度を何点か降ること、10％vs8%ゲルでの比較をしてみたところ、バンドがやや太く現れるようになりました。 うまく転写されていなかったかもしれません。今後はゲル濃度を変えて行っていこうと思います。 トランスファー効率はゲル全体で均一なものかと思っていたのですが、言われてみれば10％ゲルからトランスファーするときは、マーカーですら250 kD付近のバンドが完全には転写されずゲル側に残っていることがよくあります。 これまで高分子量のタンパクを標的にすることが無かったのであまり気に留めていなかったのですが、今回のことで勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.13211-11 - 2026/02/14 (土) 07:44:15 - おお >高分子はトランスファー効率が落ちるのでよほどうまくやる方法を知っていないと検出しにくくなる。 これは１０％均一ゲルの場合の話ですので加筆しておきます。 ３０kDaを同じゲルからのトランスファーでみたいときは８％程度 ３０kDaを別のゲルで見ていいなら６から７．５％とか。 私の手ではこのあたりならトランスファーは許容範囲です。トランスファーをウェットでオーバーナイトにすればよりしっかりトランスファーされることが多いです。感覚的には６％より下げる必要はないかと。６％でもゲルが扱いにくくなってくるし、サイズ的にもそれより下げる必要を感じません。

(無題) 削除/引用 No.13211-10 - 2026/02/13 (金) 19:54:04 - まっくろん 　私もより低い濃度（4%〜6%とか）のゲルか，グラジェントゲルがいいと思います。自作の場合，低分子量のものも見たいのであれば，2種類のアクリルアミド濃度（4%と12%とか）を重層して作成すればグラジェントっぽい分離も可能だと思います。うちでは高濃度の方に10%くらいの割合でグリセロールを入れて作ったゲルを使用してます（同じタイミングでガラス板に入れて作ることができるので楽）。

(無題) 削除/引用 No.13211-9 - 2026/02/07 (土) 03:56:46 - おお グラジェントゲルでいいと思うけど。高分子はトランスファー効率が落ちるのでよほどうまくやる方法を知っていないと検出しにくくなる。自作ならグラジェントゲルめんどくさいということなら８％ぐらいなら私の系では２５kDaが先端に来るぐらいなので３０は見れる。 泳動時間を長くするのは今回のケースであまり意味がないと思いますよ。狙いは何だったのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.13211-8 - 2026/02/06 (金) 20:39:33 - み 200kDaなら6、7パーセント。 10パーセントなら1cm入ったかどうかですよね。そのような条件で勝負しても何だかなあ。 2枚ゲル作製して蛋白量を数点振れば至適化できるでしょう。 トランスファー効率も上がるし、他の高分子量蛋白とも分離されるので、見やすくなると思う。

(無題) 削除/引用 No.13211-7 - 2026/02/06 (金) 19:35:00 - 774R タンパク量はバンドの太さではなく濃さで定量するので、細くても量を反映した数値が得られると思います。ただ、見た目で直感的に差が分かりにくいというのはその通りですね。

(無題) 削除/引用 No.13211-6 - 2026/02/06 (金) 18:46:05 - うえす 皆様、コメントいただきありがとうございます。 大変参考になります。 ちょうど、おおさんのコメントにあった「尖った鉛筆で直線を書いたようなバンド」で、見慣れない形状だったので何か間違えたかと思ってしまいました。 目的のタンパクの分子量はおよそ200 kD、分離ゲル濃度は10％です。 同じゲル上で30kD付近のタンパクも一緒に発現量を調べており、あまり泳動時間を長くできずにいました。 グラジェントゲルを使用した方が良いという指摘もあったのですが、前任の方がこの条件でも200 kD付近でいわゆるバンドらしいバンドを検出していたので、それで出来るならと踏襲していました。 皆様が仰るように、単純に量的に少ないということなのかもしれません。 サンプル量を振ってみるというのは試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.13211-5 - 2026/02/05 (木) 08:24:10 - 歩兵 バンドがブロードになるという悩みはよく聞きますが逆なのですね。前任者よりも実験がていねいなのでバンドがシャープになってるのかも。 定量性に不安があるのであれば、サンプル量を振って泳動して確認してみては？

(無題) 削除/引用 No.13211-4 - 2026/02/05 (木) 03:41:32 - おお 実際のデーターを見ていないのでなんとも言い難いですけど、バンドがシャープなのは分解能が高い可能性がありそれなら良いコンディションで流せているのだと思います。個人的な経験としてはバッファーなどの工夫で尖った鉛筆で直線を書いたようなバンドを検出したことがあります。 違う可能性としてはケミルミのシグナルが弱く光が周辺に届かない場合があるかもしれません（X線フィルムではそうですが、今使われるイメージャーでそれが言えるかというのは深く考えたことがありませんけど）。言い換えるとシグナルが強くなるほど、バンドは太ってくるということです。 バンドの形状は絶対的なものはありません。下（低分子側）に量に依存して厚みを増すばあい。疎水性が強い場合は下に厚みを増すという感じでなく直線的になる場合もあると聞きます。糖修飾を受けている蛋白はスメアになりがちですし、リン酸化したものなどが混在する場合、分子量が上下にぶれますのでバンドが複数に分かれるほどの違いがなければ見た目バンドは太くなったりもします。サンプルが違うとそういった要因でのバンドの形状の違いは顕著になるかもしれません。 そういうことで個人的にはそんなに気にしませんけど、もし定量性に支障があるかどうか不安な場合はもう一度流してみて定量に再現性があるか確認してみてもいいかもしれません。 グーグルのイメージ検索などで色々なバンドのでかたを見てみてもいいかも。

(無題) 削除/引用 No.13211-3 - 2026/02/04 (水) 20:50:55 - wedrftgy そのタンパク質のSDS-PAGEでの分子量および分離ゲルの濃度はどのくらいですか。BPBのフロントラインがゲルから出てもいいので泳動を続け、有色分子量マーカーを目印に、みたいものがいい感じのところに来たら止めるとかも良いと思います。 タンパク質量を今の２〜10倍くらいまで何点か振って泳動してみたらどうでしょうか。単に量が少なくてシグナルが弱い（細い）のかもしれないし。 濃縮ゲルも切り離さずにblottingしてみましょう。>250KD高分子量タンパク質の場合、レアケースではありますがゲルのトップ（濃縮ゲルと分離ゲルの間くらい）で溜まってることがあります。実験を繰り返すためにサンプルを何度も凍結融解したりしてると特に。こころ当たりあれば新たに調製した検体でやってみましょう。 還元剤添加後、加熱処理あり、なしで比較してみましょう。多数回膜貫通タンパク質や、もともと巨大分子だと加熱によりSDS耐性のaggregateを形成して不溶化してゲルに入らなくなる（well 直下で止まる）ことあります。かろうじて溶けたわずかな分が泳動されることはありますがアプライした量に見合わない弱いシグナルになります。 使用している抗体の活性低下など、blotting以後の過程に原因はあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.13211-2 - 2026/02/04 (水) 18:36:09 - み シャープなバンドの何が悪いのかよくわかりませんが。 高分子量って何キロダルトンよ？ ゲル濃度を６パーセントとかに下げるなり、泳動時間を長くしたりすればゲルの中央までもってこれるのでは？ そもそも量的に少ない蛋白は細くなって当然でしょうから、アプライ量を増やすか、画分をエンリッチするか、ECLなど検出試薬の感度を上げるとかで見え方は変わるかもね。

高分子量サンプルのWB 削除/引用 No.13211-1 - 2026/02/04 (水) 16:30:51 - うえす 博士課程1年生です。 WBを始めて2年ほど経ちますが、まだトラブルシューティングには慣れていない状況で、ご教示いただけますと幸いです。 ざっくりした定量を目的として、ある高分子タンパクの検出にＷＢを行っています。 しかし、引き継いだプロトコールに則って行っているにもかかわらず、再現が取れず困っています。 状況としては、目的のタンパクのバンドが線のようにシャープになってしまいます。 （伝わるか分かりませんがパワポの図形でイメージすると、よくあるバンドの太さを6ptくらいとしたとき、目的のバンドは1ptくらいイメージです） 定量してできないことはないのですが、結果を信じて良いのか不安です。 引継ぎしていただいた方の実験結果では、目的のバンドはよくある太さをしていました。 また、目的のタンパクの検出に使う抗体のデータシートでも、一般的な像です（ブロッキング剤や抗体希釈液の指定はありませんでした）。 他のサイズのタンパクは問題なく検出できているため、実験操作には大きな問題はないと考えています。 『バイオ実験イラストレイテッド』を読むと、ゲル上部ではタンパクはバンドがシャープになりやすい、と書かれていたものの、対処法が分からずにいます。 こういったことはよくあるか、仕方ない現象なのでしょうか。 もし対処法をご存知の方がいらっしゃれば、ご教示いただけますと幸いです。

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